醫(yī)學遺傳學：第16章 遺傳病的診斷

1、Chapter 16 Diagnosis of Genetic DisordersDNA-based methods do not replace haematological and biochemical investigations形態(tài)學家族史血常規(guī) （MCV,MCH）生化檢測基因檢測//sites/genetests/Gene Diagnosis 基因診斷-指利用分子生物學技術，檢測體內DNA或RNA在結構或表達水平上的變化，從而對疾病做出診斷的方法，通常又 稱 為 分 子 診 斷 ( M o l e c

2、u l a r Diagnosis)。/yuet.kanThe Father of Gene Diagnosis簡悅威簡悅威Strategies for Gene Diagnosis基因診斷的策略1. 直接診斷：直接檢測突變2. 間接診斷：連鎖分析（Linkage Analysis）ATP7BD13S313D13S314D13S316PaternalMaternalAaAaD13S313PMSonFetus1234基因產物水平診斷舉例：1. 654地中海貧血（見，p299）2. BCR-ABL融合基因基因診斷的技術q染色體水平q大片

3、段缺失 重復q基因倒位q基因融合q小片段缺失 重復q點突變q堿基修飾核酸分子雜交聚合酶鏈式反應（PCR)基因芯片基因測序 核酸分子雜交（Nucleic acid hybridization）1. 來源不同的DNA（或RNA）片段，按照堿基互補關系形成異源雙鏈分子的過程。2. 探針（Probe）：帶有某些標記物的特異性核酸序列片段3. 來源：DNA，cDNA，人工合成的寡核苷酸片段4. 基本方法：印跡雜交和點雜交Southern印跡雜交 Northern印跡(Northern blot)雜交是應用DNA探針檢測特異mRNA的另一種膜上印跡技術。 是由Alwine于1977年建立的

4、。后經Thomas等人改進。 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉錄情況。Northern印跡雜交Northern印跡雜交流程圖 與Southern印跡雜交比較： RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染 所用的器材最好與Southern印跡實驗的分開使用 RNA變性的方法：不能用堿變性，因為堿會水解RNA 2-OH 變性劑的作用：防止RNA分子形成發(fā)夾式的二級結構，以保持其單鏈線形狀態(tài)點雜交正向：是將待檢樣（DNA、RNA 或細胞）直接點到膜上，烘烤固定反向：是將探針固定點雜交（Dot-Blot）q點雜交不需電泳和轉膜過程，整個操作過程簡便、快速。q特別適合做點突變反向點雜交（Reve

5、rse Dot-Blot） 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性退火延伸三個基本反應步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。PCR 循環(huán)- 第一步 加熱變性PCR 循環(huán)- 第二步 引物與模板DNA分子退火Primer 1Primer 253553533PCR 循環(huán)- 第三步 - 引物延伸Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase第1個 PCR 循環(huán)完成后 得到兩個拷貝的靶序列30次循環(huán)后靶序列擴增的數量循環(huán)數循

6、環(huán)數 擴增產物量擴增產物量 （2n）121222243238424165253262664202201,048,576302301,073,741,824模板DNA94變性55退火72引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7PCR原理示意圖1234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（）適溫

7、延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點9555引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第1輪結束94第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點945572TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第2輪結束PCR的基本原理PCR

8、反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增p在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經變性、退火、延伸三步, 模板DNA數量翻一倍(假設擴增效率為100%)。p如此反復循環(huán)，便可使DNA以指數形式進行擴增。每完成一個循環(huán)需24min， 23h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。p實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。p在PCR反應體系中，Real-time PCR的熒光標記物可分為兩種：熒光染

9、料標記和熒光探針標記。1. 熒光染料法p SYBR熒光染料 (SYBR Green based Quantitative PCR) 能特異性地摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。 此方法未使用目的特異性探針，其特異性完全由引物決定。在有非特異雙鏈DNA產生時，其熒光也同樣增強，此法與常規(guī)PCR的特異性差別不大。 q SYBR Green 能結合到雙鏈DNA的小溝部位q SYBR Green 只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光q 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光q 復性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR

10、Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBR Green 53激發(fā)激發(fā)53SG發(fā)射發(fā)射SGSGSGSG5353激發(fā)激發(fā)SGSGSG發(fā)射發(fā)射SGSG不摻入雙鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號 SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈,發(fā)出熒光信號Taqman技術 （TaqMan probe） 2. 熒光探針法與目標序列互補與目標序列互補5端標記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針3端的熒光Q分子吸收

11、5端熒光R分子的熒光信號 探針5端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來 熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數與PCR數量成比例 5353QRQ53R53激發(fā)激發(fā)5353激發(fā)激發(fā)RQ引物Taq 酶DNA Microarray DNA芯片技術DNA Microarray DNA芯片技術 熒光原位雜交Fluorescence in situ hybridization 比較基因組雜交Comparative genomic hybridization（CGH） 多重探針連接擴增Multiplex ligation-depe

12、ndent probe amplification(MLPA) 單鏈構象多態(tài)性Single Strand Conformation polymorphism（SSCP） 變性高效色譜分析Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) DNA sequencing第一代：雙脫氧核苷酸末端終止法Born13 August 1918Rendcomb, Gloucestershire, EnglandDied19 November 2013 (aged 95)Cambridge, E

13、ngland第二代：焦磷酸測序（Pyrosequencing） DNA sequencing DNA sequencing第三代：單分子實時測序（Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT)The DNA sequencing is done on a chip that contains many ZMWs (Zero-mode waveguide)Inside each ZMW, a single active DNA polymerase with a single molecule of single stra

14、nded DNA template is immobilized to the bottom The signal from a phospho-linked nucleotide incorporated by the DNA polymerase is detected as the DNA synthesis proceeds which results in the DNA sequencing in real time Developed by Pacific Biosciences 15-minute, $100 human genome sequencing 開展個體化診斷與治療

15、依賴于基因/基因組序列 第一代測序技術：雙脫氧核苷酸末端終止測序法 一個測序反應可讀有效長度：500bp 1000bp（1Kb） 完成一個人基因組測序：3000000Kb（3000Mb） 費用：20元3000000 6000萬元 第二代測序技術：焦磷酸測序技術（高通量） Roche 454，運行1次可測 1000000Kb/1萬美元（3萬美元） Illmina，運行1次可測 2個人的基因組（3萬美元），8 day 第三代測序技術（納米、單分子、實時） 費用：30億美元 3010萬美元？ 1000美元100美元 測序時間： 15年 6周 1周 ？ 60分 15分 0 反轉錄PCR

16、（RT-PCR）16.5.3 基因診斷的實例1. 杜氏肌營養(yǎng)不良 （Duchenne muscular dystrophy ）-Deletion； Multiplex PCR/MLPA2. 鐮狀細胞貧血 （Sickle cell anemia）-Point mutation； Southern Blot/PCR-RFLP3. 654地中海貧血 （ 654 thalassemia）-Aberrant Splicing; RT-PCR4. 血友病A （Hemophilia A）-Linkage analysis5. 脆性X綜合征 （Fragile X syndrome）-Trinucleotide

17、 repeat； Southern Blot 杜氏肌營養(yǎng)不良 （Duchenne muscular dystrophy ）Xp21.2-p21.153PatientsSt(-)(+)12345DMD GENEagfbhcdea b c d e f g h . 鐮狀細胞貧血 （Sickle cell anemia）ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGA

18、CCAATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCARestriction fragment length polymorphism (RFLP)Southern Blot300bp200bp500bpPCR-ASO反向點雜交（Reverse Dot-Blot）RT-PCR 654地中海貧血 （654 thalassemia） 血友病A （Hemophilia A, HA）99bp43bp142bpBcl IBcl I142bp 血友病A （Hemophilia A, HA）16.5.4 遺傳病的診斷時機1.癥狀前診斷（Asymptomatic diagnosis）2.產前診斷 （Prenatal diagnosis）3.著床前診斷 （