銀杏葉提取物誘導(dǎo)血紅素氧合酶1表達(dá)抗缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的研究

1、銀杏葉提取物誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1表達(dá)抗缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的研究【關(guān)鍵詞】 銀杏葉提取物；,血紅素氧合酶-1；,再灌注損傷；,凋亡摘要：目的探討銀杏葉提取物（EGb761）誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1（HO-1）表達(dá)抗缺血再灌注損傷（IRI）后心肌細(xì)胞凋亡的效果及其機(jī)理。方法48只兔隨機(jī)均分為單純IRI組、EGb761組、EGb761+ZnPP組，分別預(yù)先給予等容積的生理鹽水，EGb761，EGb761+ZnPP腹腔內(nèi)注入。24 h后，每組任選8只處死，檢測心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)及活性，余兔結(jié)扎冠脈左前降支使心肌缺血40 min，再灌注4 h，取缺血心肌檢測中性粒細(xì)胞浸潤、丙二醛（MDA）含量

2、、Bax蛋白與Bcl-2蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果與單純IRI組及EGb761+ZnPP組比較，EGb761組HO-1表達(dá)及活性均明顯升高，中性粒細(xì)胞浸潤及MDA含量明顯降低，Bax 增加而Bcl-2降低，心肌細(xì)胞AI顯著減少(均為P<0.01)。與單純IRI組比較，EGb761+ZnPP組HO-1表達(dá)增加但活性降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)，其余指標(biāo)均無顯著差異。結(jié)論EGb761能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)，并通過HO-1的抗炎、抗氧化等作用下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，從而顯著抑制IR損傷后心肌細(xì)胞

3、凋亡。1 / 15關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物； 血紅素氧合酶-1； 再灌注損傷； 凋亡Abstract：ObjectiveTo explore the protective effects and mechanism of heme oxygenase-1 (HO-1) expression induced by extract of Ginkgo biloba(EGb761) against cardiomyocyte apoptosis from ischemia reperfusion injury(IRI).Methods48 rabbits were randomly divided in

4、to simple IR group, EGb761 group and EGb761+ ZnPP group. Each rabbit in different groups was intraperitoneal injected with saline(5ml), EGb761(10mg/kg), EGb761(10mg/kg)+ ZnPP(7.5mg/kg) respectively. 24 hours later, 8 rabbits in each group were killed to measure myocardial HO-1 expression and HO-1 ac

5、tivity. Other rabbits were subjected for 40min of myocardial ischemia by ligation of left anterior descending coronary artery followed by 4h of reperfusion. The neutrophil infiltration, myocardial malonaldehyde(MDA) content, Bax and Bcl-2 protein expression, cardiomyocyte apoptosis index(AI) in isch

6、emia areas were detected.ResultsCampared with simple IRI group and EGb761+ ZnPP group, the expression and activity of myocardial HO-1 increased significantly, the neutrophil infiltration and MDA content decreased. Bax expression increased and AI and Bcl-2 level decreased in EGb761 group(P<0.0

7、1 respectively). Compared with simple IRI group, EGb761+ ZnPP group showed higher myocardial HO-1 expression but lower HO-1 activity (P<0.01), while the MDA content increased (P<0.05),but the neutrophil infiltration, Bax and Bcl-2 expression and AI showed no significant difference.Conc

8、lusionEGb761 could induce HO-1 overexpression, through its antiinflammatory and antioxidative action to upregulate Bcl-2 and downregulate Bax, thus protect against cardiomyocyte apoptosis from IRI.Key words：Extract of Ginkgo biloba; Heme oxygenase-1; Reprfusion injury; Apoptosis 銀杏葉提取物(EGb761)被廣泛用于缺

9、血性心、腦血管病的防治并取得了良好效果。一般認(rèn)為，EGb761抗缺血損傷的效果主要是源于其有效成分銀杏黃酮直接清除自由基的作用和萜類內(nèi)酯的抗血小板活化作用1。有研究揭示，銀杏葉提取物中富含的銀杏黃酮成分還能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(HO-1)2。根據(jù)研究，采用基因轉(zhuǎn)染的方法促使大鼠心肌細(xì)胞特異高表達(dá)HO-1能抑制缺血再灌注損傷(IRI)心肌細(xì)胞凋亡3。銀杏葉提取物能否誘導(dǎo)在體心肌細(xì)胞高表達(dá)HO-1并據(jù)此抑制IRI后心肌細(xì)胞凋亡，迄今少見這方面的研究報道。我們擬對此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究并初步探討其中的作用機(jī)制。1 材料與方法1.1 分組、動物模型制作及取材選用健康日本大耳白兔24只，體

10、重2.12.4 kg，雌雄不拘，隨機(jī)均分為單純IRI組、EGb761組、EGb761+ZnPP3組，每組16只。各組兔預(yù)先分別給予相等容積（5 ml）的生理鹽水、EGb761(10 mg/kg，貴州益佰制藥股份有限公司產(chǎn)品)、EGb761(10 mg/kg)+ZnPP(7.5 mg/kg，Sigma公司產(chǎn)品)腹腔內(nèi)緩慢注入，兔自由攝食和進(jìn)水。24 h后，每組先任選8只活殺，取左室前壁心肌檢測HO-1表達(dá)及活性，余兔經(jīng)耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，沿胸骨左緣切開，小心剪開心包，保持胸膜完整以使兔能維持自主呼吸，在距冠脈左前降支根部23 mm處穿線打活結(jié)，拉緊絲線使心肌缺血（心肌呈紫紅

11、色）40 min，隨即松開絲線使心肌再灌注（心肌恢復(fù)紅色）4 h，迅速處死兔并摘取心臟，剪下左心室，生理鹽水漂洗后-80凍存待測各項(xiàng)指標(biāo)。1.2 HO-1蛋白表達(dá)的免疫組化分析及HO-1活性測定取左室前壁心肌采用SABC免疫組化法（抗體購于武漢博士德公司）檢測心肌細(xì)胞中HO-1的表達(dá)，顯微鏡下觀察見細(xì)胞漿染成褐色者即為HO-1陽性表達(dá)細(xì)胞。用CD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)，在200倍鏡下隨機(jī)選測5個視野的平均光密度值代表HO-1蛋白表達(dá)量。另取部分左室前壁心肌加入蔗糖-Tris緩沖液制備勻漿，差速離心法分離微粒體，考馬亮蘭法測定蛋白濃度，根據(jù)HO-1降解血紅素生成膽紅素的原理，參考何潔4的方法，

12、以每毫克蛋白每小時催化生成膽紅素的nmol數(shù)代表HO-1活性（nmol・mg-1・h-1）。1.3 中性粒細(xì)胞浸潤檢測參照Mullane6的方法，采用測定髓過氧化物酶(MPO) 活性的方法代表缺血區(qū)心肌中性粒細(xì)胞浸潤量，以25下每分鐘分解1 mol過氧化物作為1u。1.4 丙二醛(MDA)含量測定取缺血區(qū)心肌采用硫代巴比妥法按試劑盒（購于南京建成生物研究所）說明書進(jìn)行測定。1.5 Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)的免疫組化分析取缺血區(qū)心肌常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，采用SP免疫組化法參照試劑盒（購自DAKO公司）說明書檢測Bax，Bcl-2

13、蛋白表達(dá)，檢測Bax以AEC顯色，胞漿中有紅色顆粒者為Bax表達(dá)陽性細(xì)胞，檢測Bcl-2以DAB顯色，胞漿中有棕褐色顆粒者為Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞。用CD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)，在200倍鏡下隨機(jī)選測5個視野的平均光密度值代表Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)量。1.6 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)檢測取缺血區(qū)心肌常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟至水，使用TUNEL法凋亡檢測試劑盒（購自Bochringer Mannheim公司）檢測心肌細(xì)胞凋亡。光鏡200倍下觀察，核染成棕色者為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個視野，每個視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞AI。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)

14、驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以 ±s表示，組間比較采用F+q檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)量及HO-1活性比較免疫組化檢測顯示，單純IRI組、EGb761+ZnPP組及EGb761組心肌細(xì)胞胞漿分別呈淺褐色、褐色及深褐色，3組間HO-1蛋白平均光密度值及HO-1活性均有明顯差異。結(jié)果見表1。2.2 心肌中性粒細(xì)胞浸潤及MDA含量比較EGb761組PMO活性及MDA含量均較其余兩組顯著降低，EGb761+ZnPP組MDA含量明顯高于單純IRI組，但PMO活性與單純IRI組無明顯差異。2.3 Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞AI比較單純IRI組和EGb761+ZnPP組Ba

15、x表達(dá)陽性細(xì)胞較多，Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞較少，有大量凋亡的心肌細(xì)胞（圖1，圖2）。EGb761組則是Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞多而Bax表達(dá)陽性細(xì)胞及凋亡的心肌細(xì)胞均較少（圖3），Bax，Bcl-2蛋白平均光密度值及心肌細(xì)胞AI在EGb761組與單純IRI組和EGb761+ZnPP組比較均有顯著差異，而在單純IRI組與EGb761+ZnPP組之間比較則無明顯差異。見表1。TUNEL標(biāo)記法 ×200圖1 單純IRI組見較多胞核染成棕色的凋亡心肌細(xì)胞（略）TUNEL標(biāo)記法 ×200圖2 EGb761+ZnPPIX組見大量胞核染成棕色的凋亡心肌細(xì)胞（略）TUNEL標(biāo)記法 ×

16、;200 圖3 EGb761組見少量胞核染成棕色的凋亡心肌細(xì)胞（略）表1 兩組各項(xiàng)檢測指標(biāo)的比較（略）與單純IRI組比較，*P<0.05， *P<0.01;與EGb761+ZnPP組比較，#P<0.05，#P<0.013 討論急性心肌IRI廣泛存在于急性冠脈綜合征、體外循環(huán)手術(shù)、心臟移植、心臟驟停與心肺復(fù)蘇等過程中。業(yè)已證明，除嚴(yán)重缺血即刻引起心肌細(xì)胞壞死外，凋亡是早期輕度缺血，特別是再灌注過程中心肌細(xì)胞的主要死亡方式。已有研究顯示，IRI致心肌內(nèi)大量中性粒細(xì)胞浸潤與活化，不斷產(chǎn)生活性氧，包括H2O2，O2-，ONOO- 等，它們對心肌細(xì)

17、胞造成直接氧化應(yīng)激損傷的同時，還會誘導(dǎo)促凋亡基因表達(dá)，引起心肌細(xì)胞大量凋亡7。這種凋亡最早于IRI后1 h開始出現(xiàn)，數(shù)小時至數(shù)天達(dá)高峰，一直可延續(xù)至4周后。凋亡是導(dǎo)致IRI后心肌細(xì)胞進(jìn)行性減少、左室重構(gòu)與擴(kuò)張的重要原因8。雖然近年臨床上強(qiáng)調(diào)以急診介入治療等方式盡早開通閉塞冠脈以顯著縮小心肌梗塞面積，但卻不能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡?？梢姡芯靠笽RI后心肌細(xì)胞凋亡同限制急性期心肌梗死面積一樣對改善遠(yuǎn)期心功能狀態(tài)和預(yù)后意義重大。本文采用兔急性心肌IRI模型作研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予EGb761能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)及活性升高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行IRI實(shí)驗(yàn)，則心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物M

18、DA含量均明顯降低，Bax蛋白表達(dá)減少而Bcl-2蛋白表達(dá)升高，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)則顯著降低，EGb761+ZnPP組由于使用ZnPP特異性抑制了HO-1的表達(dá)及活性，結(jié)果EGb761的作用被完全消除，表現(xiàn)為心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，MDA含量、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)和心肌細(xì)胞AI均與單純IRI組相近而與EGb761組差異顯著，提示，本實(shí)驗(yàn)中提前24 h靜注的EGb761并非直接起效而是主要通過誘導(dǎo)HO-1表達(dá)間接抗IRI的。已知HO-1作為起始酶和限速酶，催化血紅素降解生成膽紅素、CO和游離鐵， HO-1與其酶解產(chǎn)物膽紅素、CO共同組成細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷不可或缺的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)9，而針對HO-

19、1系統(tǒng)如何抗IRI后心肌細(xì)胞凋亡的研究則少有報道，鑒于Bax，Bcl-2是細(xì)胞凋亡最重要的一對正負(fù)調(diào)控因子，我們檢測了EGb761誘導(dǎo)HO-1表達(dá)對Bax，Bcl-2的影響，發(fā)現(xiàn)HO-1高表達(dá)可顯著降低Bax蛋白表達(dá)、升高Bcl-2蛋白表達(dá)，最終抑制IRI后心肌細(xì)胞凋亡，且這一作用可能主要是通過HO-1系統(tǒng)抑制中性粒細(xì)胞浸潤、消除自由基引起的氧化應(yīng)激損傷而實(shí)現(xiàn)的。除此之外，有研究報道，HO-1表達(dá)還可通過其酶解產(chǎn)物CO充當(dāng)氣體信號分子，直接抑制促凋亡蛋白Bax甚至P53蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用10。參考文獻(xiàn)：1 Kusmic C,Basta G,Lazzcrini G,et al.The

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