乳腺癌端粒酶活性與PCNA表達(dá)關(guān)系

1、乳腺癌端粒酶活性與PCNA表達(dá)關(guān)系【關(guān)鍵詞】 乳腺癌；端粒酶；增殖細(xì)胞核抗原；多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；免疫組織化學(xué)摘要： 目的 探討端粒酶活性與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)之間的關(guān)系及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌術(shù)后治療方案制定和預(yù)測(cè)預(yù)后的意義。方法 采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(TRAP-PCR-ELISA)和免疫組織化學(xué)鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)法對(duì)80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細(xì)胞核抗原進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 (1)80例乳腺癌患者癌組織標(biāo)本、36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中端粒酶表達(dá)陽性率分別為650%和83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2、<001)；10例乳腺良性病變組織標(biāo)本中未檢測(cè)出端粒酶活性；腋窩淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移與端粒酶陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>005)。(2)80例乳腺癌組織中PCNA的陽性表達(dá)率為6375%；乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PCNA陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<001)，且呈正相關(guān)(P<001)，即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越低，PCNA陽性表達(dá)率亦越低。(3)端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性(P<001)，且呈正相關(guān)(P<001)，一致率為8625%。結(jié)論 端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性，端粒酶活性與PCNA聯(lián)合檢測(cè)，可為乳

3、腺癌術(shù)后治療方案的制定和預(yù)測(cè)預(yù)后提供輔助依據(jù)。1 / 11關(guān)鍵詞： 乳腺癌；端粒酶；增殖細(xì)胞核抗原；多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；免疫組織化學(xué)Relationship between telomerase activation and PCNA expression in breast cancer Abstract： Objective To approach the interrelation between telomerase activation and PCNA expression in breast cancer and evaluate the significance of combin

4、ed detection in formulating therapeutic regimen after breast cancer operation.Methods The level of telomerase activation and PCNA expression were detected in 80 cases of breast cancer,36 cases of side-cancer tissues and 10 cases of lacteal gland benign lesion using TRAP-PCR-ELISA and S-P immunohisto

5、chemistry technique.Results (1)The positive rate of telomerase in 80 breast cancer tissues and 36 side-cancer tissues were 65.0% and 8.3% respectively and the difference revealed statistical significance(P<001),the telomerase activation was not examinated in 10 cases of lacteal gland benign l

6、esion;It is no significance in statistic that the level of positive rate of telomerase and the extent of axillary nodes metastasis(P>005).(2)Among 80 cases ,the positive rate of PCNA in breast cancer tissues was 63.75% and the positive rate of PCNA in group with lymphatic metastasis was signi

7、ficantly higher than that in group without lymphatic metastasis(P<001) and there was positive relationship between lymphatic metastasis and positive expression of PCNA(P<001).(3)The telomerase activation was in accordance with PCNA expression(P<001) and there was positive relati

8、onship between telomerase activation and PCNA(P<001),the concordance rate was 86.25%.Conclusion The telomerase activation is in accordance with PCNA expression,associating telomerase activation with PCNA detection can provide the ancillary evidence to predict the prognosis and to formulate th

9、e treatment plan after breast cancer operation.Key words： breast cancer;telomerase;proliferating cell nuclear antigen(PCNA);polymerase chain reaction(PCR);immunohistochemistry 增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一種表達(dá)細(xì)胞增殖周期的36kd多肽，直接參與細(xì)胞增殖過程中DNA的復(fù)制，其表達(dá)程度能客觀反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，過度表達(dá)增加了瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移趨勢(shì)的危險(xiǎn)性，

10、PCNA可作為判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)1。為探索乳腺癌組織端粒酶活性與增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的關(guān)系，對(duì)80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細(xì)胞核抗原進(jìn)行檢測(cè)。1 對(duì)象與方法11 對(duì)象 收集我院19922002年女性乳腺癌根治標(biāo)本病理檢查存檔資料80例，乳腺癌相應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤2cm以上)36例，年齡3272歲，平均年齡4846歲；乳腺良性病變10例，平均年齡3850歲。全部資料經(jīng)2位病理醫(yī)師審核，患者術(shù)前未做過放、化療。乳腺癌分類根據(jù)“中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范”分為非浸潤(rùn)性癌、早期浸潤(rùn)性癌、浸潤(rùn)性特殊癌、浸潤(rùn)性非特殊癌4類。12 試劑與儀器 端粒多聚酶鏈反

11、應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附(Telomerase PCR ELISA)試劑盒(德國Boehringer Mannhein公司)；陽性對(duì)照為腫瘤293細(xì)胞株(檢測(cè)試劑盒提供)；陰性對(duì)照為不含蛋白的裂解液；抗PCNApc10和鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)試劑盒及過氧化物酶底物作用液二氨基聯(lián)苯氨(Diaminobenzidine,DAB)(北京中山生物技術(shù)有限公司)；用已知乳腺癌組織陽性切片(北京中山生物技術(shù)有限公司)為陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)代替抗做陰性對(duì)照。酶標(biāo)儀(SPECTRA)(美國Dynex公司)PCR(T-1 thermobloc

12、k)(德國Biometra公司)。13 端粒酶活性檢測(cè) (1)端粒酶提?。好糠輼?biāo)本用病理切片機(jī)切1015m厚50片，加入預(yù)冷的端粒酶裂解液20l，放置冰上裂解30min，1600r/min 4離心20min，取175l上清液為提取液，放置于-80冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)端粒酶活性檢測(cè)：端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-多聚酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附(TRAP-PCR-ELISA)法2，3，取細(xì)胞提取液12l加入25l端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-多聚酶鏈反應(yīng)(TRAP PCR)擴(kuò)增液；無菌二乙基焦碳酸酯(diethyprocarbonate,DEPC)水補(bǔ)足至體積50l混勻；在PCR擴(kuò)增儀上按以下步驟進(jìn)行引物的延伸及擴(kuò)增反應(yīng)：

13、95 5min預(yù)變性，再以94 30s變性、50 30s退火、72 90s延伸，共循環(huán)30個(gè)周期，最后72延伸10min。取上述PCR產(chǎn)物5l加變性試劑20l混勻，置室溫10min；加入雜交液225l混勻后取出100l移至包被于抗地高辛的酶標(biāo)板中室溫作用2h；加入抗地高辛過氧化物酶并與底物作用30min后終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)其在波長(zhǎng)450nm的吸光度(A)值。14 PCNA檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)S-P法染色，按試劑盒說明書操作：所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4m連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化后高壓鍋熱處理58min，過氧化物酶阻斷血清封閉，加抗60min，PBS液洗3次，每次

14、2min；抗15min，PBS液洗3次。每次2min；抗同抗。DAB顯色510min，蘇木素復(fù)染510s，脫水，透明膠封片。15 結(jié)果判斷 端粒酶以吸收度(A)>020為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰的棕色或棕黃色顆粒為陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)，每例切片至少觀察5個(gè)高倍視野。16 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS100軟件對(duì)各組端粒酶及PCNA陽性表達(dá)率進(jìn)行2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率檢驗(yàn)和Kendall等級(jí)相關(guān)分析。2 結(jié)果21 各部位端粒酶活性表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 80例乳腺癌患者癌組織標(biāo)本端粒酶表達(dá)陽性率為650%(52/80)；36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本端粒酶表達(dá)陽性率為83%

15、(3/36)；10例乳腺良性病變組織標(biāo)本中未檢測(cè)出端粒酶活性。各部位端粒酶陽性表達(dá)率總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)，但進(jìn)一步分析，癌組織與癌旁相應(yīng)組織、癌組織與良性病變組織端粒酶陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=31975，P0001；2=15395，P0001)，而癌旁相應(yīng)組織與良性病變組織端粒酶陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>005)；端粒酶陽性表達(dá)率與部位呈正相關(guān)(rs=055,P<0001)。端粒酶陽性表達(dá)率與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=2473，P>005)。表1 PCNA陽性表達(dá)率與乳腺癌組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)

16、系（略）注：* P<005,* P<001；rs Kendall等級(jí)相關(guān)系數(shù)22 PCNA與乳腺癌組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(表1) 在80例乳腺癌標(biāo)本中，PCNA的陽性表達(dá)率為6375%(51/80)。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且PCNA陽性表達(dá)的為39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且PCNA陽性表達(dá)的為12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PCNA陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<001)，且呈正相關(guān)(P<001)，即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越低，PCNA陽性表達(dá)率亦越低。組織類型與PCNA陽性表達(dá)率呈正相關(guān)(P<005)，即腫瘤惡性程度越高，PCNA陽性表達(dá)率亦越

17、高，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>005)。23 PCNA表達(dá)和端粒酶活性之間的關(guān)系(表2) 端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性(2=3926，P<001)，且呈正相關(guān)(rs=0643,P<001)，即端粒酶活性陽性表達(dá)率高，PCNA陽性表達(dá)率亦高。一致率為8625%(46+23)/80。表2 PCNA表達(dá)和端粒酶活性之間的關(guān)系（略）3 討論研究表明，幾乎所有的永生細(xì)胞和絕大部分惡性腫瘤組織均有明顯的端粒酶活性，而正常細(xì)胞、部分良性腫瘤組織和非永生細(xì)胞系中則無或僅有極低的端粒酶活性4。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者癌組織標(biāo)本端粒酶陽性表達(dá)率顯著高于乳腺癌相

18、應(yīng)癌旁組織和乳腺良性病變組織，而乳腺良性病變組織中無端粒酶活性的表達(dá)。端粒酶陽性表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。上述結(jié)果與俞喬5報(bào)道一致。有文獻(xiàn)報(bào)道6，瘤細(xì)胞增殖活性高者，PCNA高表達(dá)，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明PCNA過度表達(dá)增加了瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。本研究結(jié)果顯示，PCNA陽性表達(dá)率在乳腺癌淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組分別為750%和4286%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)；且PCNA陽性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)(P<001)。PCNA陽性表達(dá)率與乳腺癌組織類型間雖呈一定的正相關(guān)(P<005)，但各組間PCNA陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>005)，可能與本次研究樣本量較少有關(guān)。另外，本結(jié)果顯示，端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性且呈正相關(guān)，說明端粒酶活性陽性表達(dá)率高，PCNA陽性表達(dá)率亦高，2者具有協(xié)表達(dá)的關(guān)系，臨