環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)ppt課件

1、第八章 環(huán)境微生物的分別與鑒定技術(shù) 微生物純培育的分別方法 微生物分類鑒定的經(jīng)典方法 微生物的快速鑒定技術(shù) API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) Enterotube系統(tǒng) 微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) DNA堿基組成(G+C)mol%分析 Biolog方法鑒定環(huán)境微生物群落技術(shù) 16S rRNA序列分析技術(shù) 核酸雜交技術(shù) DNA芯片技術(shù) DNA指紋圖譜技術(shù)一、微生物純培育的分別方法 固體平板分別純培育 稀釋平板法 平板劃線法 單細(xì)胞分別法 菌絲尖端分別法 液體培育基分別純培育 利用選擇培育基分別二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法指長期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的一些關(guān)于形狀、生理、生化、生態(tài)、生活史和血清學(xué)反響等目的的

2、鑒定方法。微生物分類鑒定的根據(jù)：形狀特征個(gè)體形狀特征培育特征生理生化特征常用的生化反響：糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、三糖鐵(TSI)瓊脂實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽復(fù)原實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、尿素酶實(shí)驗(yàn)等二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法 鑒定方法： 普通先根據(jù)形狀特征鑒別其屬于哪一大類(細(xì)菌、放線菌、酵母菌或霉菌) 再根據(jù)生理生化特征、生態(tài)特征、免疫特征和遺傳特征等，借助于檢索表或鑒定手冊來依次確定是屬于哪個(gè)目、科、屬、種 對于不同的微生物有不同的重點(diǎn)鑒定目的三、微生物的快速鑒定技術(shù) API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)(簡易診檢技術(shù)、數(shù)碼分類

3、鑒定法) ADH ODC H2S TDA VP GLU INO RHA MEL ARAONPG LDC CIT URE IND GEL MAN SOR SAC AMY三、微生物的快速鑒定技術(shù) Enterotube系統(tǒng)美國Roche公司消費(fèi)的Enterotube系統(tǒng) Biolog法 Biolog測定原理： 微孔板，每板含有96個(gè)孔，其中95個(gè)孔中參與了95種單一碳源和四唑染料，另外一個(gè)未加碳源的孔中加水為對照，環(huán)境微生物接種至孔中，孔中一旦有電子轉(zhuǎn)移，四唑染料就會(huì)變?yōu)樽仙?，顏色的深淺可以反映環(huán)境微生物對碳源的利用程度 該方法由美國BIOLOG公司于1989年開發(fā)勝利，至今已能鑒定包括細(xì)菌、酵母菌

4、和霉菌在內(nèi)的2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。三、微生物的快速鑒定技術(shù)四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) Biolog法 Biolog系統(tǒng)組成： 96個(gè)孔微孔板 讀數(shù)器：讀取一波長下小孔內(nèi)吸光度及變化 微機(jī)系統(tǒng) ：與讀數(shù)器相連，自動(dòng)完成數(shù)據(jù)采集、傳輸、存貯與分析 方法操作 平板選擇 樣品制備 加樣 培育與讀數(shù) 數(shù)據(jù)分析四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) DNA(G+C)mol%值的測定 DNA(G+C)mol%值是微生物(除少數(shù)以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒)的一個(gè)根本遺傳特征，對特定微生物來說，(G+C)mol%是恒定的。 (G+C)mol%=(G+C)(mol)/(A+T+G+C)(mol)100% (G

5、+C)mol%的變化范圍較廣，原核生物為20-80，真核生物為30-60。 完全不同的微生物能夠有相近的(G+C)mol%，但(G+C)mol%有明顯差別的微生物一定不會(huì)屬于同一個(gè)種。 普通以為，種內(nèi)菌株間(G+C)mol%相差不超越4%，屬內(nèi)菌株間相差不超越10%，相差低于2%時(shí)沒有分類學(xué)意義四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) DNA(G+C)mol%值的測定 DNA(G+C)mol%值可所用測定方法的不同和測定誤差等而有差別 該方法操作簡單，但分率力不高 (G+C)mol%的測定方法 熱變性溫度測定法(Tm法) 紙層析法 高效液相色譜法 浮力密度法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) 核酸雜交技術(shù) 核酸

6、雜交是指具有一定互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補(bǔ)配對原那么締結(jié)成異質(zhì)雙鏈的過程 DNA-DNA同源性分析 DNA-rRNA同源性分析 雜交方法 固相雜交法：一是待測菌的DNA或RNA，二是用于檢測的知序列DNA或片段，即探針?biāo)?、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) DNA芯片技術(shù) DNA芯片技術(shù)是指將多達(dá)成千上萬種的探針分子按照特定的陳列方式固定在固相載體(多數(shù)采用玻片)上，組成密集的微點(diǎn)陣或陣列，利用核酸雜交原理，用知序列的DNA分子，按照堿基互補(bǔ)配對的原那么，與標(biāo)志的特異性單鏈DNA或RNA分子雜交構(gòu)成雙鏈，經(jīng)過檢測雜交信號的強(qiáng)弱來判別樣品中靶分子的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)核酸序列的分子識別。 D

7、NA芯片技術(shù)的最大優(yōu)勢是可以同時(shí)、快捷、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)基因組的信息 DNA芯片技術(shù)的改良使得DNA診斷不斷小型化并具有高效率。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) 16S rRNA序列分析技術(shù) 根本原理 細(xì)菌體內(nèi)有3種不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA。它們分別行使著不同的功能，其中rRNA可將遺傳信息得以表達(dá)，轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，它在一切細(xì)菌中都有一定的堿基序列和空間構(gòu)造。細(xì)菌種類不同，rRNA序列不同。 原核生物的rRNA是由兩個(gè)亞基所組成：50S和30S，而30S亞基進(jìn)一步由3種類型組成，即23S、16S和 5S rRNA，它們分別含有約 2900、1500和 120個(gè)核苷酸。16S r

8、RNA相對分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化間隔相順應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，再加上16S rRNA可直接從DNA中轉(zhuǎn)錄而直接測序，因此，如今普通普遍采用16S rRNA作為序列分析對象對微生物進(jìn)展測序分析。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) 16S rRNA序列分析技術(shù) 分析方法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) 16S rRNA序列分析技術(shù) 分析方法 從樣品中分別總微生物DNA PCR擴(kuò)增 16S rRNA基因片段分析 將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上進(jìn)展直接測序 經(jīng)過16S rRNA種屬特異性的探針與PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息 對PCR產(chǎn)物進(jìn)展梯度凝膠電泳分析，直接察看

9、其多樣性 對PCR產(chǎn)物進(jìn)展DNA指紋圖譜分析四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) 16S rRNA序列分析技術(shù) 應(yīng)留意的問題 提取的DNA要可以代表樣品中環(huán)境微生物的遺傳多樣性 防止核酸污染出現(xiàn)PCR假陽性結(jié)果 抑制混合環(huán)境微生物基因組DNA PCR出現(xiàn)的不均等擴(kuò)增景象 排除PCR產(chǎn)物中的嵌合序列 防止探針雜交中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) DNA指紋圖譜技術(shù) 限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP) 其原理是利用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在特定位點(diǎn)上將細(xì)胞基因組DNA切割成不同長度的片段，然后在瓊脂糖凝膠上電泳分別后對所得圖譜進(jìn)展分析比較得出分類結(jié)論，以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長度多態(tài)性。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù) DNA指紋圖譜技術(shù) 隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析(RAPD) 其原理是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數(shù)目能夠不同，因此采用核苷酸序列的隨機(jī)引物進(jìn)展基因組DNA擴(kuò)增，非特異性引物可以結(jié)合在模板DNA的多個(gè)位點(diǎn)，產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳將產(chǎn)物分別，