人免疫球蛋白G(IgG)ELISA檢測方法及步驟

1、人免疫球蛋白G(IgG) ELISA檢測方法及步驟人(Human) 免疫球蛋白G (IgG) ELISA檢測試劑盒本試劑僅供研究使用 標本：血清或血漿 試驗原理：IgG試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知IgG濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將IgG和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中IgG的濃度呈比例關(guān)系。 試劑盒內(nèi)容及其配制試劑盒成份(2-8保存)96孔配置48孔配置配制96/48人份酶標板1塊板(96T)半塊板(4

2、8T)即用型塑料膜板蓋1塊半塊即用型標準品：80g/L1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按說明書進行稀稀空白對照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)即用型標準品稀釋緩沖液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型生物素標記的抗IgG抗體1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型親和鏈酶素-HRP1瓶(10ml)1瓶(5.0ml)即用型洗滌緩沖液1瓶(20ml)1瓶(10ml)按說明書進行稀釋底物A1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型底物B1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型終止液1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型標本稀釋液1瓶(12ml)1瓶(6.0ml)即用型 自備材料1蒸餾水

3、。2加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3振蕩器及磁力攪拌器等。 安全性1避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。2實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。3不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 操作注意事項1試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。2實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。3不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。4使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。5使用干凈的塑料容器配置洗滌液。

4、使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。6洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。7底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。8加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。9按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。 樣品收集、處理及保存方法1、血清-操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。2、血漿-EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

5、3、細胞上清液-1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。4、組織勻漿-將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液5、保存-如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 試劑的準備1標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：80 g/L(6號標準品)原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。40 g/L(5號標準品)100ul的原倍標準品加入100u

6、l的標準品稀釋液20 g/L(4號標準品)100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液10 g/L(3號標準品)100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液5.0 g/L(2號標準品)100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液2.5 g/L(1號標準品)100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液0 g/L(空白對照)原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 2洗滌緩沖液(50×)的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。 操作步驟1使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。2根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。3加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37溫育1小時。4甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。5每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37溫育30分鐘。6甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌