川芎嗪對BMT后小鼠骨髓基質(zhì)細胞bFGF表達水平的影響

1、川芎嗪對BMT后小鼠骨髓基質(zhì)細胞bFGF表達水平的影響 作者：吳寧，周登鋒，齊潔琳，張錫芹，步兵，劉蒲香， 王明玉， 孫漢英， 劉文勵【摘要】 本研究探討川芎嗪對骨髓移植（BMT）后小鼠骨髓基質(zhì)細胞bFGF表達水平的影響及其促進骨髓造血重建的機制。取健康BALB/c小鼠，隨機分為3組：正常組（不做處理），BMT+生理鹽水組（簡稱生理鹽水組）和BMT +川芎嗪治療組（簡稱川芎嗪組）。生理鹽水組和川芎嗪組分別胃飼生理鹽水0.2毫升/只和川芎嗪注射液每次2毫克/只，2次/天，直至處死為止。在BMT后第7、14、21、28天處死小鼠，用RT-PCR和Western blot方法檢測骨髓基質(zhì)細胞bFGF

2、 mRNA及其蛋白表達水平。結(jié)果表明： BMT后第7、14、21天川芎嗪組和生理鹽水組骨髓基質(zhì)細胞bFGF mRNA及其蛋白的表達均明顯低于正常組（P<0.01或P<0.05），但川芎嗪組明顯高于生理鹽水組（P<0.01或P<0.05），到第28天，川芎嗪組bFGF mRNA及其蛋白的表達已恢復(fù)正常，而生理鹽水組仍未恢復(fù)正常，兩組之間有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論：川芎嗪可能通過增加bFGF的表達水平而促進骨髓微環(huán)境的修復(fù)，加速BMT后骨髓的造血重建。 【關(guān)鍵詞】 川芎嗪； 骨髓移植； 骨髓基質(zhì)細胞； 堿性成纖維細胞生長

3、因子2 / 17Effect of Ligustrazine on the Expression of bFGF in bone marrow stromal cells of mice after BMTAbstractThis study was purposed to investigate the effect of ligustrazine on the expression of bFGF in bone marrow stromal cells (BMSC) and to explore the mechanism of hematopoietic reconstitution

4、after bone marrow transplantation (BMT). The mice were randomly divided into 3 groups： normal group,saline group and ligustrazine group. BMT mouse models were established. The mice of normal group were not treated, the mice of saline group were given normal saline (0.2 ml/mouse, twice a day) through

5、 gastric tube, while the mice of ligustrazine group were given ligustrazine (0.2 ml/mouse, twice a day) through gastric tube. On day 7, 14, 21 and 28 after BMT, the femora were taken and the bone marrow mononuclear cell (BMMNC) suspensions were used for the cultivation of bone marrow stromal cells a

6、ccording to Dexter's culture method. The mRNA and protein expressions of bFGF in BMSC were assayed by RT-PCR and Western blot respectively. The results showed that the expression of bFGF in BMSC on the level of mRNA and protein were all reduced significantly after BMT, and increased slowly with

7、the time. On day 7,14 and 21 after BMT, the expressions of bFGF mRNA and protein in bone marrow stromal cells of ligustrazine group and saline group were lower than that in bone marrow stromal cells of normal group, but the expressions of bFGF mRNA and protein in ligustrazine group were obvionsly hi

8、gher than that in saline group (P<0.01 or P<0.05). On day 28 after BMT, the expressions of bFGF mRNA and protein in ligustrazine group returned to normal level, while the expressions of bFGF mRNA and protin in saline group not returned to normal level, there was significant difference

9、between these two groups. It is concluded that ligustrazine can enhance bFGF expression level in bone marrow stromal cells after syngeneic bone marrow transplatation in mice, which confirms that ligustrazine can enhance the repair of bone marrow microvessels, improve bone marrow microenvironment and

10、 promote hematopoietic reconstitution.Key wordsligustrazine; bone marrow transplantation; bone marrow stromal cell; bFGF造血干細胞（HSC）移植是目前治療多種難治性血液病主要手段之一。受者在BMT前需要接受大劑量的放療、化療。骨髓是對輻射敏感的器官之一。射線不僅殺傷骨髓中的造血細胞，而且對骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細胞及其分泌的生長因子也有特異性的影響1。以往我們的研究表明，川芎嗪通過促進骨髓微血管系統(tǒng)修復(fù)、增加骨髓微環(huán)境供氧、改善骨髓微環(huán)境，并促進骨髓基質(zhì)細胞生長及其黏附能力，促進

11、造血干細胞增殖2。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）是一種多功能的細胞因子，與其特異性受體（bFGFR）結(jié)合后刺激內(nèi)皮細胞增殖、移行，促進血管新生，為一種血管新生誘導(dǎo)因子。本試驗通過觀察川芎嗪對骨髓移植(BMT)后小鼠骨髓基質(zhì)細胞bFGF表達的影響，進一步探討川芎嗪促進BMT小鼠造血重建的作用機制。材料和方法實驗動物清潔級近交系BALB/c小鼠（H-2d， MLSb），8-10周齡，18-22克，雌雄兼用（湖北省實驗動物中心提供）。每只小鼠于照射前3天到照射后14天喂飼慶大霉素水（200 U/day）清潔腸道。藥物鹽酸川芎嗪注射液

12、20 g/L（無錫市第七制藥廠產(chǎn)品，批號030822）。試劑和儀器兔抗小鼠bFGF、bFGFR單克隆抗體（Santa Cruz Biotechology公司提供）；NBT/BCIP染色試劑盒(武漢中健公司產(chǎn)品)，PCR引物（上海生物工程公司合成）；TRIZOL、PCR kit、DL2000 Marker（TaKaRa公司產(chǎn)品）；DEPC、RNase A酶、PI（Promega公司產(chǎn)品）；FITC-山羊抗兔 IgM單克隆抗體（北京中山公司產(chǎn)品）；流式細胞儀（Becton Dickinson產(chǎn)品）。分組及處理 BALB/c小鼠72只，隨機分為3組。正常組8只（未作任何處理）；BMT+生理鹽水組（以

13、下簡稱生理鹽水組）及BMT+川芎嗪組（以下簡稱川芎嗪組）各32只。移植前4小時小鼠均經(jīng)60Co 線全身均勻照射，總劑量7.5 Gy，劑量率為1.644 Gy/min。BMT模型的建立3：取正常的BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死后立即取雙側(cè)股骨制備單個核細胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×107/ml，4小時內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入受照射的生理鹽水組及川芎嗪組小鼠體內(nèi)（供體鼠和受體鼠比例為14），注入細胞數(shù)為2×106/只，液體量0.2毫升/只。制成BMT模型后，川芎嗪組小鼠立即喂飼鹽酸川芎嗪注射液2毫克/只，每天2次；生理鹽水組喂飼生理鹽水，0.2毫升/只，每天2次。以上兩組均用藥至處死

14、為止。骨髓有核細胞計數(shù)(BMNC) 于BMT后7，14，21，28天頸椎脫臼法處死小鼠，稱重，浸入75%乙醇中3分鐘，然后取雙側(cè)股骨，用RPMI 1640從骨髓腔沖出有核細胞，按白細胞計數(shù)方法，計數(shù)有核細胞。骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)分別于BMT后7、14、21、28天處死小鼠，參照Dexter方法4進行骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)。每周半量換液1次，至貼壁細胞長滿為止（14-21天）。骨髓基質(zhì)細胞bFGF蛋白表達的Western blot分析參照分子克隆實驗?zāi)?進行。 分離、收集BMNC后，加入5倍體積的細胞裂解液并混勻，冰上裂解20分鐘，離心吸上清即為細胞總蛋白。蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)移按照說明書進行。

15、兔抗小鼠bFGF單克隆抗體（1500稀釋）4孵育過夜，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG單克隆抗體（14 000稀釋二抗），37孵育1小時，用PBS洗膜，NBT/BCIP顯色。對Western blot的特異性條帶進行灰度掃描，以積分光密度×面積（mm2）表示條帶的信號強弱，以此對目的蛋白表達水平進行半定量比較。數(shù)據(jù)以各組條帶積分光密度×面積/未處理組條帶積分光密度×面積表示。骨髓基質(zhì)細胞bFGF mRNA水平表達的RT-PCR檢測參照分子克隆實驗指南5進行。采用GeneFisher1.3軟件設(shè)計引物序列：bFGF上游引物：5-GGAGAAGAGCGACCCACAC

16、G-3，下游引物：5-GCAGACATTGGAAGAAACAG-3。-actin 上游引物：5-GGACCTCTGAGAGCTTCACGCCCAGTGA-3，下游引物：5-GCCAGAGAATGTTGCTGAGGAGGTGGGG-3。用TRIZOL試劑盒，按說明提取骨髓基質(zhì)細胞總RNA并測定純度。93預(yù)變性1分鐘，93變性30秒，72延伸60秒。bFGF 56退火30秒，共35個循環(huán)，循環(huán)后72延伸8分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統(tǒng)對DNA條帶掃描，以目的基因掃描密度值/-actin基因掃描密度值的百分數(shù)（%）作為目的基因mRNA的相對表達量。bFGF擴增產(chǎn)物大小為

17、288 bp，-actin為400 bp。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 ( ±SD) 表示，采用 SAS 10.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。結(jié)果骨髓基質(zhì)細胞bFGF蛋白表達水平分析BMT后第7至21天，川芎嗪組和生理鹽水組bFGF蛋白表達水平均明顯低于正常組（P<0.05或P<0.01），但川芎嗪組明顯高于生理鹽水組（P<0.05或P<0.01）；到BMT后第28天川芎嗪組已基本恢復(fù)正常，而生理鹽水組仍未恢復(fù)正常，兩組之間有顯著性差異（P<0.01）（圖1、2）。骨髓基質(zhì)細胞bFGF mRNA表達水平分析 分別

18、于BMT后第7、14、21、28天取BMNC培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，待其長滿培養(yǎng)孔底時提取RNA進行RT-PCR分析。圖3、4為RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（擴增產(chǎn)物為288 bp小鼠bFGF特異條帶，內(nèi)參照大小為400 bp）。BMT后7至21天川芎嗪組和生理鹽水組小鼠骨髓基質(zhì)細胞bFGF mRNA表達顯著下降，隨著時間延長川芎嗪組在第28天已恢復(fù)正常水平，但生理鹽水組仍明顯低于正常（P<0.05或 P<001）(圖5）。討論骨髓造血微環(huán)境在結(jié)構(gòu)上分為基質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)，其中骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells, BMSC)是骨髓造血微環(huán)境的核

19、心，它通過與造血細胞密切接觸，可以持續(xù)穩(wěn)定地分泌多種細胞因子（包括正、負造血調(diào)控因子）調(diào)節(jié)造血，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于保護機體造血的穩(wěn)定性具有十分重要的作用。骨髓是對輻射敏感的器官之一，射線在損傷造血細胞的同時對骨髓微環(huán)境也有一定程度的損傷，而損傷后骨髓造血功能的恢復(fù)必須先有血管系統(tǒng)特別是靜脈竇的修復(fù)和血流的重建，以保護細胞成長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和體液因子，促進造血細胞、基質(zhì)細胞的生長發(fā)育及其功能。bFGF既是一種高度特異的內(nèi)皮細胞絲裂原，又是血管生成素、細胞生長因子6，具有多種功能，且與細胞遷移、分化及組織發(fā)育有關(guān)。血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、T、B淋巴細胞、巨核細胞、血小板等為其特異性靶細胞

20、。bFGF通過與靶細胞表面特異性受體（bFGFR）結(jié)合刺激內(nèi)皮細胞增殖、移行，增加血管通透性，調(diào)節(jié)血管新生及血管形成。在以往的研究中，我們實驗小組已經(jīng)證實,川芎嗪可以明顯減少骨髓移植早期骨髓內(nèi)基質(zhì)出血，改善骨髓微環(huán)境供氧，加快早期骨髓血管網(wǎng)絡(luò)修復(fù)，促進造血微環(huán)境的恢復(fù)7。川芎嗪還能上調(diào)骨髓基質(zhì)細胞FAK、SCF、VEGF的表達8,9，促進骨髓基質(zhì)細胞增殖，調(diào)控造血過程，并可以促進骨髓組織中HS、CD44、CD31、ICAM-1的表達10-13，后者參與介導(dǎo)造血干細胞黏附定居和增殖分化，能夠加快骨髓移植后的造血重建。在實驗中我們觀察到： bFGF在BMT后不同時間點小鼠骨髓基質(zhì)細胞中有不同程度的

21、表達。表明基質(zhì)細胞可產(chǎn)生分泌bFGF。BMT后第7、14、21天川芎嗪組和生理鹽水組小鼠骨髓基質(zhì)細胞bFGF mRNA及其蛋白的表達水平均低于正常組，隨著造血的恢復(fù)其表達逐漸增高，說明骨髓造血微環(huán)境受損影響骨髓基質(zhì)細胞分泌細胞因子。BMT后第7、14、21、28天川芎嗪組骨髓基質(zhì)細胞bFGF mRNA及其蛋白的表達水平均高于同一時間點生理鹽水組，提示川芎嗪可增強骨髓基質(zhì)細胞bFGF的表達。由此，我們推斷，川芎嗪通過增強放射損傷小鼠骨髓基質(zhì)細胞堿性成纖維細胞生長因子bFGF的表達，促進造血微環(huán)境中微血管和靜脈竇的修復(fù)和血流的重建，為造血細胞和基質(zhì)細胞的增殖分化提供了所必需的氧、營養(yǎng)物質(zhì)及體液因子

22、，促進了骨髓造血?！緟⒖嘉墨I】 1 Greenberger JS, Anderson J, Berry LA,et al. Effects of irradiation of CBA/CA mice on hematopoietic stem cells and stromal cells in long-term bone marrow cultures. Leukemia,1996;10:514-5272 孫漢英，舒硯君，劉文勵等. 川芎嗪改善免疫誘導(dǎo)再障小鼠骨髓微環(huán)境的作用研究. 中華血液學(xué)雜志，1998; 19：178-1803 林治棟. 骨髓基質(zhì)細胞及其輻射殘留損傷. 國外醫(yī)學(xué)·放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊，2001; 25：282-2844 Dexter TM, Moore MA, Sheridan AP. Maintenance of hematopoietic stem cells and production of differentiated progeny in allogeneic and semiallogeneic bone marrow chimeras in vitro. J Exp Med, 1977; 145:1612-16165 Katoh O, Takahashi T, Oguri T,