倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡的使用

1、倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡的使用摘要：倒置相差顯微鏡是相差顯微鏡與倒置顯微鏡的結(jié)合，能夠在倒置的情況下觀察到普通顯微鏡所不能清楚的觀察的活細胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，在細胞培養(yǎng)、顯微操作技術(shù)等方面有了廣泛的應(yīng)用。 熒光顯微鏡利用物質(zhì)激發(fā)產(chǎn)生的微弱的熒光形成明亮的觀察圖像，在生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域已經(jīng)成為一種不可替代的觀察和測試手段，能夠精確的對生物標(biāo)本中的特定組分、微量熒光染料進行分析研究。關(guān)鍵詞：倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、使用1 .倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡的工作原理1.1 倒置相差顯微鏡的工作原理在顯微鏡下鏡檢時，視場中的樣品只有在反射光的波長（顏色）和振幅（亮度）與周圍 介質(zhì)有變化時，

2、方能窺見被檢樣品?；畹臉悠范酁闊o色透明，照明光線通過這種物體時，透 過或反射光的波長和振幅都不發(fā)生改變，所以用普通光學(xué)顯微鏡難以辨清活體的結(jié)構(gòu)。必須借助于固定和染色等理化方法，使樣品和背景的反射或透射光在波長和振幅上發(fā)生變化，即在顏色和亮度上有所差異，以供識別。相差方法應(yīng)用于生物學(xué)上的主要價值，在于它能對透明的活體進行直接觀察，無需采用 使細胞致死的固定和染色的方法。染色合活體以有害的影響，甚至失真。由此，才使相差法顯得異常重要。1.2 熒光顯微鏡的工作原理熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光 （如紫外光365nm或紫藍光420nm）作為激發(fā)光，激發(fā)檢測標(biāo)本內(nèi)的

3、熒光物質(zhì)發(fā)射出 各種不同顏色的熒光后，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)的放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像的光學(xué) 顯微鏡，是醫(yī)學(xué)檢驗中的重要儀器之一。2 .倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)2.1 倒置相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)倒置相差顯微鏡是相差顯微鏡與倒置顯微鏡的結(jié)合，即具有倒置顯微鏡的倒置觀察方式與同相差顯微鏡相一致的成像原理。倒置相差顯微鏡的照明系統(tǒng)位于鏡體上方，而物鏡和目鏡則位于下部。這樣在集光器和載物臺之間有較大的工作距離，可以放置培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶等容器，輔助以相差的光學(xué)系統(tǒng)，可以很方便地對培養(yǎng)中的細胞進行觀察。2.1.1 相差物鏡（phase contrast objective）相差物鏡是顯微鏡特有的重要裝置。

4、在相差特鏡內(nèi)的后焦面上裝有種類不同的相板。相 板由于前述的作用， 造成視場中被檢樣品影像與背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因物鏡內(nèi)相板種類或構(gòu)成的不同，物鏡在明暗反差上可區(qū)分為兩大類，即明反差（B）或負反差（N）物鏡和暗反差（D）或正反差（P）物鏡。物鏡的反差類別，用英文字母B或N或D或P標(biāo)志在物鏡外殼上，并兼有高H （High）、中M（Medium）和低L （Low）等三種不同的反差。有的相差物鏡用ph字樣的標(biāo)示。同一反差類別的物鏡，依放大率的不同，又可分為10X、20X、X 40、和100X數(shù)種，因此，相關(guān)物鏡種類頗多，一套可多達20余種。相差物鏡多為消色差物鏡或平場消色差物鏡（PL）

5、。2.1.2 轉(zhuǎn)盤聚光器（turret condenser）位于鏡臺之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光鏡和環(huán)狀光闌（annular diapheragm）構(gòu)成。環(huán)狀光闌位于聚光鏡之下，是一種特殊的光闌裝置，由大小不同的環(huán)狀通光孔構(gòu)成， 不同規(guī)格的通光孔一一環(huán)狀光闌裝配在一個可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，按需要調(diào)轉(zhuǎn)使用。環(huán)狀光闌的環(huán)寬與直徑各不相同，與不同放大率的相差物鏡內(nèi)的相板相匹配，不可濫用。轉(zhuǎn)盤前端朝向使用者一面有標(biāo)示窗（孔）,轉(zhuǎn)盤上的不同部位標(biāo)有 0、1、2、3和4或0、10、20、40和 100字樣，通過標(biāo)示窗顯現(xiàn)。“0”表示非相差的明視場的普通光闌。1或10、2或20、3或40和4或100,表示

6、與相應(yīng)放大率的相差物鏡相匹配的不同規(guī)格的環(huán)狀光闌的標(biāo)志。通過手動轉(zhuǎn)入的標(biāo)示窗內(nèi)之?dāng)?shù)字，表示該數(shù)字所代表的環(huán)狀光闌已進入光路。2.1.3 合軸調(diào)中望遠鏡（centering telescop©合軸調(diào)中望遠鏡簡稱 CT,又名合軸調(diào)中目鏡。它是眼透鏡，可行升降調(diào)節(jié)，具有較長 的焦距的一種望遠目鏡。 鏡筒較長，其直徑與觀察目鏡相同。它的功用僅作為環(huán)狀光闌的環(huán)孔（亮環(huán)）與相差物鏡相板的共軻面環(huán)孔（暗環(huán)）的調(diào)中合軸與調(diào)焦之用。相差顯微鏡使用 時，轉(zhuǎn)盤聚光器的環(huán)狀光闌與相差目鏡必須匹配，且環(huán)狀光闌的孔環(huán)與相差物鏡相板共軻面的環(huán)孔在光路中要準(zhǔn)確合軸，并完全吻合或重疊。以保證直射光和衍射光各行其路，使

7、成像光線的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷恼穹?。但是，鏡體的光路中前述兩環(huán)的影像較小，一般目鏡難以辨清，不能進行調(diào)焦與合軸的操作，非借助合軸調(diào)中望遠鏡不可。2.1.4 綠色濾色鏡（green filter）相差物鏡的種類，從色差消除情況來分，多屬消色差物鏡（ achromatic objective ）或PL 物鏡。消色差物鏡的最佳清清晰范圍的光譜區(qū)為510630nm。欲提高相差顯微鏡的性能最好以波長范圍小的單色光照明，即接物鏡最佳清晰范圍的波長的光線進行照明。所以，使用相差物鏡時，在光路上加用透射光線波長為500600nm左右的綠色濾色鏡，使照明光線中的紅光和藍光被吸收，只透過綠光，可提高物鏡的分辨能力

8、。 該濾色鏡兼有吸熱的作用，以利活體觀察。2.2 熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)2.2.1 光源熒光顯微鏡具特殊光源（多為紫外光光源），提供足夠強度和波長的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光?，F(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作， 中間呈球形， 內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時，可達 5070個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需515min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此為熒光顯微鏡普遍采用。但是超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的

9、散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。2.2.2 濾色系統(tǒng)濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點。2.2.3 光學(xué)系統(tǒng)熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要由反光鏡、聚光器、物鏡、目鏡、落射光裝置組成。其中反 光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區(qū)吸收少。一般使用平面反光鏡。聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成，分為明視野聚光器、暗視野聚光器 以及相差熒光聚光器三種。在物鏡的使用上，熒光顯微鏡各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯

10、微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比， 所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。在熒光顯微鏡中，目鏡經(jīng)常使用雙筒低倍目鏡。3 .倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡的使用方法3.1 倒置相差顯微鏡的使用現(xiàn)在實驗室中使用的倒置相差顯微鏡一般是在普通倒置顯微鏡的基礎(chǔ)上添加相差裝置， 因此在使用時需要注意相差裝置與顯微鏡的配合使用。1）相差裝置的調(diào)換安裝。卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把 綠色濾光片放在上面， 它可吸收紅色和藍色光， 使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡

11、。2）調(diào)焦。打開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“o”對準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進進光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操縱方法進行對光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40 x時應(yīng)用x40標(biāo)示孔的光闌。3）合鈾調(diào)整。拔出目鏡，插進合鈾看遠鏡，一邊從看遠鏡內(nèi)內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒； 一邊用右手轉(zhuǎn)動看遠鏡內(nèi)筒使其下降，當(dāng)對準(zhǔn)焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)， 此時可將看遠鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合，如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內(nèi)側(cè)時，應(yīng)降低集光器使亮環(huán)放大；反之，

12、則應(yīng)升高聚光器，使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合，則可能是載玻片過厚之故，應(yīng)更換。合抽調(diào)整完畢，抽出看遠鏡，換回目鏡，按 常規(guī)要領(lǐng)進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調(diào)整。使用油鏡時，集光器上透鏡表面與載玻片之間要同時加上香柏油。3.2 熒光顯微鏡的使用方法1）打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達到最亮點。2）透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插進所要求的激發(fā)濾片/雙色束分離器/ 阻斷濾片的插塊。3）用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個照明 光斑的中心。4）放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀