植物生理學實驗論文張壽麗

1、干旱脅迫對小麥幼苗某些生理生化指標的影響（班級：13應(yīng)生 學號：134120258 姓名：張壽麗）摘要： 以小麥種子為實驗材料，用TTC和曙紅染色的方法測定小麥種子的發(fā)芽率。再以正常生長的小麥幼苗和干旱脅迫七天的小麥幼苗為實驗材料，用對照的實驗方法，通過紫外分光光度計測定小麥幼苗抗氧化酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、谷胱甘肽（GSH），H2O2的含量變化，得出干旱脅迫對上述這些生理生化指標的影響。實驗結(jié)果表明：干旱脅迫下，小麥幼苗的抗氧化酶(POD)活性及丙二醛(MDA)，脯氨酸（Pro），谷胱甘肽（GSH），H2O2的含量均增加，表現(xiàn)出有效的抗旱效應(yīng)，說明在干旱脅迫下，

2、植物能夠通過合成自身所需的以上物質(zhì)來達到抗旱的作用，而且這些物可以作為植物抗旱的指標來對植物進行抗旱評價。關(guān)鍵詞：小麥、發(fā)芽率、干旱脅迫、生理生化指標。引言： 干旱是植物最易遭受的脅迫之一，每年由于干旱脅迫給農(nóng)業(yè)造成的損失幾乎相當于其他所有環(huán)境因子脅迫所造成的損失的總和。1 干旱脅迫對植物的影響是一個復(fù)雜的生理生化過程，涉及到許多大分子和小分子。2研究表明，有理的脯氨酸在植物細胞抵抗非生物脅迫的過程中扮演著非常重要的角色，許多新的生理生化功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)。干旱是一種最常見的脅迫，遇此逆境作物進行氣孔調(diào)節(jié)外，滲透調(diào)節(jié)也是一種有效的方法。原理是通過加強合成代謝，增加細胞內(nèi)滲透物質(zhì)濃度，降低滲透勢，

3、維持膨壓和細胞正常生理功能。脯氨酸作為水溶性最大的氨基酸具有較強的水合能力，是理想的滲透介質(zhì)。作物遇到干旱是它的積累有助于細胞或組織持水，防止脫水，故可視為作物對干旱環(huán)境的一種適應(yīng)。 已經(jīng)證明了在逆境條件下脯氨酸的積累來抵抗植物對非生物脅迫的傷害，植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)也能將傷害細胞的活性氧控制在可忍耐的水平內(nèi)，通過各種過氧化酶的協(xié)同作用，可以把細胞內(nèi)產(chǎn)生的具有很強氧化性的活性氧如O2，H2O2，0H-等直接或間接的清除，防止了活性氧放大聯(lián)級作用，保證了細胞內(nèi)生命活動的正常進行。丙二醛是由植物衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的，對干旱也具有抵抗作用。GSH作為生物

4、體內(nèi)最主要的非蛋白巰基和含量最豐富的低分子量多肽，在植物抗逆中直接參與許許多多的功能活動。列如當細胞內(nèi)生成少量H2O2是，GSH在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，把H2O2還原成H2O，其自身被氧化為GSSG，GSSG由存在于肝臟和活細胞中的谷胱甘肽還原酶催化作用下，接受H還原成GSH,使體內(nèi)自由基的清除反應(yīng)能夠繼續(xù)持續(xù)進行。所以在干旱脅迫中由于細胞被破壞并產(chǎn)生有毒物質(zhì)H2O2等，細胞機體就會合成H2O2等有毒物質(zhì)，細胞機體就會合成大量的GSH保護自身。一、實驗材料及試劑、儀器1、實驗材料：50粒吸脹的小麥種子，正常生長的小麥幼苗，干旱處理過的小麥幼苗。2、實驗試劑：TTC染液，曙紅染液，3%磺基

5、水楊酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用10% TCA配制）， PBS (pH=6.8，內(nèi)含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 ，PBS（pH=6.0,內(nèi)含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反應(yīng)混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反應(yīng)混合液（ 20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS現(xiàn)配)。3、實驗儀器：分光光度儀，離心機，試管，微量加樣器，研缽等。二、測定

6、項目種子的發(fā)芽率，抗氧化酶（POD）活性的測定， 丙二醛（MDA）含量的測定，脯氨酸（Pro）含量的測定，H2O2的含量的測定.三、實驗方法1、種子發(fā)芽率的測定：取50粒吸脹的小麥種子沿胚的中心線切成兩半（嚴格區(qū)分兩個半粒）其中50個半粒進行TTC染色（30水浴 20 min），另50個半粒進行曙紅染色（室溫染色10 min）洗凈后觀察。根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計算發(fā)芽率。2、Pro含量的測定：（1）Pro的提取：分別取0.1 g實驗組和對照組的幼苗加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研缽5000 rpm離心10 min 量上清液體積。（2)

7、 測定：上清液各2 mL 分別加入 2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心10 min（若沒沉淀可略此步驟） 分別測定A520。(3）計算：Pro content = (mmol.g-1FW)3、MDA含量的測定：（1）MDA提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 0.3 % TCA 和少許石英砂充分研磨用2 mL 0.3 %TCA洗研缽5000 rpm離心10 min 量上清液體積。（2）測定：分別取上清液各2 mL 加入0.5%TBA（用10%TCA配制） 2 mL 煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心5 min （視沉淀有無）分別測定

8、OD450和OD532（3）計算： OD450=C1*85.4 OD532=C1*7.4+155000*C2 求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71OD450 C2/(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450 示中C1為可溶性糖的濃度；C2為MDA的濃度。4、H202含量的測定：（1）H2O2提取：分別取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 0.3%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用2 mL TCA洗研缽5000 rpm離心10 min 量上清液體積。（2）測定：分別取上清液各4 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制0. 2 mL搖

9、勻 OD410(3)計算：H2O2 content = (mmol.g-1FW)5、抗氧化酶活性的測定：（1）抗氧化酶的提取：分別取0.1 g實驗材料加入少許石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,內(nèi)含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨轉(zhuǎn)入離心管中用2 ml提取液洗研缽 5000 rpm離心10 min 量上清液體積用于測定POD和PPO酶活性或分裝后轉(zhuǎn)至-20或-80保存。 （2）POD測定：取POD反應(yīng)混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3 ml，加入酶液50 ml（空白調(diào)零用提取液取代），立即記時，搖勻，讀

10、出反應(yīng)0.5和1.5 min時的A470。（3）PPO測定：取PPO反應(yīng)混合液（ 20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）3 ml，加入酶液0.1 ml（空白調(diào)零用提取液取代），立即記時，搖勻，讀出反應(yīng)0.5和1.5 min時的A410。 以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（U），則：（4） 計算：(mmol.g-1FW)POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)PPO activities = (U.g-1FW)6、GSH含量的測定（1)GSH的提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組的幼苗加入3 mL 3%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用

11、2 mL 3% TCA洗研缽 5000 rpm離心10 min 量上清液體積。（2）測定：上清液各2 mL (空白用3%三氯乙酸代替) 分別加入0.4 mL1M NaOH 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min測定A412GSH content = (mmol.g-1FW)（3）計算：五：實驗結(jié)果與分析1、 小麥種子發(fā)芽率的測定實驗中，TTC染色的小麥種子有45粒有生命活力，有5粒沒有生命活力；曙染色的小麥種子也是有45粒有生命活力，有5粒沒有生命活力。 發(fā)芽率=有生命活力種子數(shù)÷種子總數(shù)=45÷50=90% 表一 小麥種子發(fā)芽率發(fā)芽率 （%）小麥曙紅染色90%TT

12、C染色90%分析：由實驗結(jié)果可得，小麥種子的發(fā)芽率較高，且兩種染色方法的結(jié)果是一樣，說明在切種子時切得較均勻。2、 Pro的含量測得對照組的A520=0、443實驗組的A520=3.000計算得對照組Pro content=13.72mmol.g-1FW實驗組Pro content=91.67mmol.g-1FW 表二 Pro對照組和實驗組的A520和Pro content正常小麥幼苗干旱脅迫的小麥幼苗A520=0.443Pro content =13.72mmol.g-1FWA520=3.000Pro content =91.67mmol.g-1FW分析：從上表數(shù)據(jù)可得經(jīng)過干旱脅迫的小麥幼苗

13、的脯氨酸的含量大量增加，說明干旱脅迫會使脯氨酸積累。脯氨酸積累可能是生物受脅迫的一個信號。且干旱是一種最常見的脅迫，遇此逆境作物進行氣孔調(diào)節(jié)外，滲透調(diào)節(jié)也是一種有效的方法。原理是通過加強合成代謝，增加細胞內(nèi)滲透物質(zhì)濃度，降低滲透勢，維持膨壓和細胞正常生理功能。脯氨酸作為水溶性最大的氨基酸具有較強的水合能力，是理想的滲透介質(zhì)。作物遇到干旱是它的積累有助于細胞或組織持水，防止脫水，故可視為作物對干旱環(huán)境的一種適應(yīng)。但理論上脯氨酸的增加量應(yīng)正常脯氨酸含量的三倍，而我們的實驗結(jié)果得出干旱脅迫是正常的六倍多，誤差較大。3、 MDA的含量測得對照組OD450=0.106 OD532=0.077實驗組OD4

14、50=2.172 OD532=0.437帶人以下公式:OD450=C1*85.4 OD532=C1*7.4+155000*C2 求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71OD450 C2/(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450 示中C1為可溶性糖的濃度；C2為MDA的濃度。得對照組MDA content=0.437umol/L實驗組MDA content=1.598umol/L表三 對照組和實驗組的A450、A532和可溶性糖及MDA的濃度。正常小麥幼苗干旱脅迫小麥幼苗A450=0.106A450=2.172A532=0.007A532=0.437可溶性糖濃度=1.241

15、mmol/L可溶性糖濃度=25.51mmol/LMDA濃度=0.437umol/LMDA濃度=1.598umol/L分析：通過實驗數(shù)據(jù)可得干旱脅迫過的小麥幼苗可溶性糖濃度和MDA濃度均增加，這與前人的研究結(jié)果3一致。張嫂發(fā)現(xiàn)干旱脅迫使黃瓜幼苗MDA含量增加4;李莉等5發(fā)現(xiàn)干旱脅迫使田間蘋果梨葉片MDA含量增加。然而丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征；使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。MDA的積累可能對膜和細胞造成一定的傷害。4、 H2O2的含量測得對照組OD410=0.392實驗組OD410=1.046計算得對照組H

16、2O2 content=6.1mmol.g-1FW 實驗組H2O2 content=16.27mmol.g-1FW表四 對照組和實驗組H2O2的A410和H2O2 content 正常小麥幼苗干旱脅迫小麥幼苗A410=0.392A410=1.064H2O2content=6.1mmo l.g-1FWH2O2content=16.27mmol.g-1FW分析：由以上實驗數(shù)據(jù)可得，干旱脅迫的小麥幼苗的H2O2含量大量增加。過氧化氫是體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，其積累對細胞具有氧化破壞作用，其含量的高低，一定程度上反映了CAT活性的高低。因此，在干旱脅迫下，有可能是CAT酶活性降低，造成過氧化氫在植物體內(nèi)的

17、積累，從而破壞了細胞的氧化作用，使植物不利于在逆境中生長。5、 抗氧化酶的活性實驗測得對照組A410=0.024 A470=0.039 實驗組A410=0.023 A470=0.107計算得對照組PPO activities=20(U.g-1FW) POD activities=3.2(mmo.g-1FWmin-1) 實驗組PPO activities = 5.4(U.g-1FW) POD activities=11.6(mmo.g-1FWmin-1)表五 對照組和實驗PPO和POD不同時間所測得值PPO和POD activities正常小麥幼苗干旱脅迫小麥幼苗PPO A410=0.024PP

18、O A410=0.023POD A470=0.039POD A470=0.107PPO activities=20(U.g-1FW)PPO activities = 5.4(U.g-1FW)POD activities=3.2(mmo.g-1FWmin-1)POD activities=11.6(mmo.g-1FWmin-1)分析：實驗數(shù)據(jù)中旱脅迫使小麥幼苗PPO活性下降而使得POD活性增加。然而有關(guān)抗氧化機理研究中已經(jīng)指出干旱脅迫的小麥幼苗內(nèi)的POD活性下降，羥基自由基清除能力及總抗氧化能力降低，總體上表現(xiàn)為抗氧化系統(tǒng)受抑制。PPO在植物中以潛伏PPO形式存在，與葉綠體膜緊密結(jié)合，潛伏形式通

19、常在成熟，衰老或脅迫條件下，由于膜受傷害而活化，并導(dǎo)致PPO活性增加。此次實驗結(jié)果誤差較大，可能是在記錄數(shù)據(jù)時出現(xiàn)了錯誤，導(dǎo)致實驗結(jié)果剛好與理論相反。6、 GSH的含量測得對照組A412=0.032實驗組A412=0.14計算得對照組GSH content=0.77mmol.g-1FW 實驗組GSH content=10mmol.g-1FW表六 對照組和實驗組GSH的A412和GSH content 正常小麥幼苗干旱脅迫小麥幼苗A412=0.032A412=0.14GSH content=0.77mmo l.g-1FWGSH content=10mmol.g-1FW分析：由實驗結(jié)果可得干旱脅迫

20、處理過的小麥幼苗GSH的含量增加。干旱脅迫中由于細胞被破壞并產(chǎn)生有毒物質(zhì)H2O2等，細胞機體就會合成H2O2等有毒物質(zhì)，細胞機體就會合成大量的GSH保護自身。六、討論（1）本次實驗我們的實驗結(jié)果是，干旱脅迫小麥幼苗使脯氨酸積累。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很強的水合能力，其水溶液具有很高的水勢。脯氨酸是一種有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫想植物體內(nèi)會迅速積累脯氨酸6-7.有人已經(jīng)證明了脯氨酸的分解代謝開始于它的氧化分解，執(zhí)行此功能的酶稱為脯氨酸脫氫酶，它以FAD為輔因子將脯氨酸降解為P5C，后者在P5C還原酶的作用下又重新合成谷安酸，完成脯氨酸的代謝過程。所以，在脯氨酸降解過程中脯氨酸脫氫酶是

21、關(guān)鍵的降解酶，在逆境脅迫過程中，PDH的活性往往受不同程度的限制，從而減弱了脯氨酸的過程，因此越來越多的脯氨酸積累。(2)丙二醛是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，干旱脅迫的加劇導(dǎo)致膜系統(tǒng)產(chǎn)生過多的氧自由基，使膜脂不飽和酸過氧化，從而使MDA含量大量增加，植物膜質(zhì)受損程度增加8。植物器官在逆境下遭受傷害，往往反射膜脂過氧化作用，丙二醛是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置放出后，與蛋白質(zhì)，核酸起反應(yīng)修飾其特征；使纖維素分子間的橋鍵松弛，或抑制蛋白質(zhì)的合成。丙二醛的積累可能對膜和細胞造成一定的傷害，其含量多少代表膜傷害的程度。實驗數(shù)據(jù)表明小麥幼苗受到了一定的傷害。（3）實驗結(jié)果表明干旱脅迫的小麥幼苗積累了一定量的H2O2。過氧化氫酶大量分布于動植物細胞內(nèi)，屬于活性氧清除劑，對H2O2和羥自由基有清除能力，是一種保護細胞酶。干旱脅迫使過氧化氫酶活性降低，導(dǎo)致H2O2積累，對小麥幼苗有一定的傷害。（4）GSH是植物中普遍存在的硫醇，在還原硫的儲存和運輸，蛋白質(zhì)和核酸合成方面均有重要作用，且在植物抗逆性方面的作用尤為作用，其主要功能是清除植物體內(nèi)的活性氧9-10。實驗結(jié)果表明，干旱脅迫下，小麥幼苗GSH含量增加，促進植株抵抗干旱。（5）有關(guān)抗氧化機理研究中已經(jīng)指出干旱脅迫的小麥幼苗內(nèi)的POD活性下降，羥