暨南大學(xué)動(dòng)物細(xì)胞工程復(fù)習(xí)題(含答案)

1、1.體外培養(yǎng)的細(xì)胞按生長(zhǎng)方式可分為哪二種? 按細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的形態(tài)特征,可分為哪幾種常見類型? 按生長(zhǎng)方式分為二型： 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。（絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞。）可分四型：(1)上皮型細(xì)胞 (2)成纖維型細(xì)胞 (3)游走型細(xì)胞 (4)多形型細(xì)胞2.簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)過程的分期及每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程通常，體外培養(yǎng)細(xì)胞的全部生命期大致可被分為以下三個(gè)階段：原代培養(yǎng)期：也稱初代培養(yǎng)，是指從機(jī)體中取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代之前的這一階段。此期的細(xì)胞呈現(xiàn)出活躍移動(dòng)的特點(diǎn)，

2、可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。處于原代培養(yǎng)階段的細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上有很大的相似性。細(xì)胞群具有明顯的異質(zhì)性，細(xì)胞間的相互依存性強(qiáng)，在軟瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞集落形成率很低。傳代期 ：通常是培養(yǎng)細(xì)胞全生命期中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的時(shí)期，原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)傳代后常被稱做細(xì)胞系。一般情況下，正常體細(xì)胞在傳代10-50次左右后，細(xì)胞分裂的能力就會(huì)逐漸減弱，甚至完全喪失，細(xì)胞便進(jìn)入衰退期。衰退期：處于衰退期的培養(yǎng)細(xì)胞，增殖速率已經(jīng)變得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。以上特點(diǎn)，主要是針對(duì)體外培養(yǎng)的機(jī)體正常細(xì)胞，對(duì)于體外發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞而言，永生性或惡型性的獲得使得這類細(xì)胞獲得持久性的增殖能力，這

3、樣的細(xì)胞群體常被稱為無限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程：游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。時(shí)間：10分鐘一4小時(shí)貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。底物：玻璃、塑料、膠原、其它細(xì)胞等潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度限制3.簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)生存環(huán)境的基本要求.細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要：基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸（種谷氨酰胺）、維生素、葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無機(jī)離

4、子。促細(xì)胞生長(zhǎng)因子：多由血清提供細(xì)胞的生存環(huán)境：溫度條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：不同生物來源的組織細(xì)胞培養(yǎng)溫度不同；體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞最常用的溫度是37，耐低溫不耐高溫。在生理溫度范圍內(nèi)，溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)率之間存在正相關(guān)關(guān)系。 氣相環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的氣相環(huán)境都是采用5%CO2與95%空氣（提供氧）的混合氣體。2參與細(xì)胞的能量代謝過程，2用于維持培養(yǎng)液的酸堿度，一般多為開放式培養(yǎng) 培養(yǎng)液的酸堿度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：大多數(shù)的有機(jī)體細(xì)胞能在pH6.08.0的環(huán)境中生存。最適宜的pH值范圍是7.27.4。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力無污染、無毒。4什么是細(xì)胞培養(yǎng)用液,主要分為哪幾類?

5、培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液。主要包括：平衡鹽溶液 ； 培養(yǎng)基； 其他培養(yǎng)用液 。5D-Hanks與Hanks的主要區(qū)別是什么?D-Hanks不含有Ca2+、Mg2+ ，常用于配制胰酶溶液。6簡(jiǎn)述胰酶的常用濃度及配制時(shí)的注意事項(xiàng)。胰酶(trypsin)溶液： 濃度一般為0.10.25，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液 。7.細(xì)胞培養(yǎng)中血清的主要作用？ (1)提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) ； (2)提供貼壁和擴(kuò)展因子 (3)提供激素及各種生長(zhǎng)因子； (4)提供結(jié)合蛋白 (5)對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用 8.血清的使用與儲(chǔ)存有哪些注意事項(xiàng)？（

6、1）使用前的處理：使用前通常在56加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。對(duì)于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新生牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。（2）儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存于20,同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融 。大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如10ml、20ml、50ml，儲(chǔ)存于-20，使用前融化。融化后的血清在4不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)盡快使用。9.簡(jiǎn)述干粉培養(yǎng)基的配制過程。DMEM培養(yǎng)液的配制（舉例）： 900 mL ddH2O于1000 mL燒杯中，將DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。用51

7、0的NaHCO3調(diào)pH至7.2。加青、鏈霉素至終濃度100u/mL 和100ug/mL 用0.22um的濾膜過濾除菌。分裝（200 mL左右）后4冰箱保存。 10.細(xì)胞培養(yǎng)工作室可分為那幾個(gè)部分，各有什么作用?一般包括：準(zhǔn)備室、培養(yǎng)室和緩沖室。作用：準(zhǔn)備室：用于進(jìn)行培養(yǎng)器皿的清洗、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備和消毒以及供應(yīng)物品的保藏等。培養(yǎng)室：用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各種無菌操作的實(shí)驗(yàn)室。其基本條件是：清潔、無菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。天花板不宜高過2.5M。緩沖室：（更衣室）11. CO2培養(yǎng)箱的作用及使用中的注意事項(xiàng)。用于維持適當(dāng)溫度、濕度與pH。注意事項(xiàng)：質(zhì)量關(guān)鍵在控溫裝置，溫度變化一般不應(yīng)

8、超過0.5度;培養(yǎng)箱的溫度設(shè)在3537，這是人和哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度。培養(yǎng)容器需與外界保持通氣狀態(tài)。箱內(nèi)空氣應(yīng)保持干凈，定期消毒（紫外燈、酒精）水槽:保持一定濕度12. 試述清潔液的配方組成及配制時(shí)的注意事項(xiàng)。清潔液 :重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml），強(qiáng)清潔液 631000200 ，次強(qiáng)清洗液 120 2001000 ，弱清潔液 100 1001000配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸，并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色13簡(jiǎn)述消毒滅菌的常

9、用方法、要求條件及主要應(yīng)用范圍。物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿。消毒時(shí)間：30min（至少）； 紫外殺菌功能除了紫外本身以外，還可以由產(chǎn)生的臭氧來完成。紫外滅菌以后，最好過一個(gè)小時(shí)再進(jìn)去。過濾：0.22m（適用于液體）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）15磅,121，20min各種物品有效消毒壓力和時(shí)間不同，一般要求如下： 培養(yǎng)用液、橡膠制品 l0磅l0分鐘 布類、玻璃制品、金屬器械等 15磅20分鐘干烤：160, 2 小時(shí)（適用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打開箱門，以防冷空氣驟然進(jìn)入引起玻璃炸裂，影響消毒效果?；瘜W(xué)消毒滅菌法：7%酒精 主要用于操作者的

10、皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。1新潔爾滅 主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?？股?主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的抗生素是青霉素（常用濃度是100u/ml）與鏈霉素（100g/ml）。不要在原代培養(yǎng)中加入抗生素 。14. 如何對(duì)玻璃器皿進(jìn)行有效清洗？玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗(+烘干)浸酸沖洗；清洗后的玻璃器皿：干凈透明無油跡。浸泡： 初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等。先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然

11、后用5稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的殘留蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面光澤度。自然晾干或烘干后泡酸。浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液（洗液）中。清潔液對(duì)玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時(shí)間：一般為過夜，不應(yīng)少于6 小時(shí)。沖洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗,使之盡量不留污染或清潔液的殘跡。最好用洗滌裝置。如

12、用手工操作，需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，然后用蒸餾水清洗3-5 次，晾干（或烘干）備用15細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的抗生素及使用濃度是什么?青霉素（常用濃度是100u/ml）與鏈霉素（100g/ml）。16什么是原代培養(yǎng)？簡(jiǎn)述原代培養(yǎng)方法的分類及主要操作步驟。原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)方法分類：貼塊法和消化法。消化法又分為冷消化與熱消化；一次性消化與分次消化。主要步驟：貼塊法：將取得洗凈并剔去多余成分的組織切成約1mm3大小的植塊，用于植塊培養(yǎng)。消化法：將取得洗凈并剔去多余成分的組織剪碎蛋白酶溶液消化機(jī)械方吹打組織塊對(duì)濾過液離心（&

13、lt;1000r/min, <10min）用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度用于分離細(xì)胞培養(yǎng)17何謂傳代培養(yǎng)？簡(jiǎn)述貼壁細(xì)胞的傳代操作步驟。傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)： 選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入23ml的D- Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。加入適量0. 0.25胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，倒去酶液。用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。以1：2或1：3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)

14、瓶上做好標(biāo)記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻， 37 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。18收集細(xì)胞時(shí)一般常用的轉(zhuǎn)速和時(shí)間是多少？轉(zhuǎn)速：1000r/min；時(shí)間：5min19. 什么是冷凍保存？影響細(xì)胞冷凍保存效果的因素有哪些？冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70的超低溫條件)，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過程。冷凍速率當(dāng)冷凍速度過慢時(shí)，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時(shí)即失去活性。冷凍速度過慢，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的

15、溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會(huì)形成較大冰晶,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。 冷凍保存溫度：液氮溫度(-196)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70-80條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降。復(fù)溫速率 指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。一般來說復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在37水浴中，于12min內(nèi)完成復(fù)溫。 在冷凍復(fù)蘇中遵循：慢凍速溶原則。冷凍保護(hù)劑：是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。分為：滲透性： 常用甘油、DMSO 非滲透性甘油或二甲基亞砜這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，

16、可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。 保護(hù)機(jī)制：是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。20凍存的細(xì)胞一般如何復(fù)蘇？1)將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至3740。2)從液氮

17、中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解。要在12min內(nèi)完成復(fù)溫。3)將細(xì)胞凍存懸液移入離心管，加入約5m1培養(yǎng)液，輕輕吹勻。 4)將細(xì)胞懸液經(jīng)8001000 r/min離心5min。棄上清液。5)給細(xì)胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。21簡(jiǎn)述培養(yǎng)細(xì)胞的非玻璃化凍存過程。非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-70-80，然后投入液氮進(jìn)行保存；該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。 凍存過程：(1)待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備 ：按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物,制備成單細(xì)胞懸液,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。將細(xì)胞懸液

18、以8001000rmin離心5min，棄上清液。向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×1061×107個(gè)/ml。按每管11.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。(2)分級(jí)冷凍：先將凍存小管放人普通冰箱冷藏層(48)，約40min。接著置于普通冰箱冷凍層(-10-20)，3060min。再于-30放置30min左右（可省略）。然后在-70-80下過夜。最后將凍存小管投入液氮保存。還有一種簡(jiǎn)單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。第三種方法是，用4預(yù)冷的冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，分裝凍存

19、小管后，將凍存小管放在4下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒內(nèi)封好，立刻將小盒放置在-70-80冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。 (3)記錄：做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及凍存經(jīng)手人。22DMSO使用時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？在使用DMSO前，不需要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身有滅菌作用。 在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制冷凍保護(hù)劑時(shí)最好帶手套。由于許多冷凍保護(hù)劑(如DMSO)在低溫條件下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫融解后要及時(shí)洗除冷凍保護(hù)劑。23. 細(xì)胞培養(yǎng)中常見有哪些微生物污染，

20、有何主要特征？真菌污染：真菌種類多，形態(tài)各異，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長(zhǎng)，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態(tài)，散在于細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。細(xì)菌污染：污染后大多能改變培養(yǎng)液pH培養(yǎng)液變混濁，毒性大的細(xì)菌很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。支原體污染：支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種污染。24運(yùn)送細(xì)胞的比較簡(jiǎn)便的方法是哪一種，簡(jiǎn)述其過程。一是用液氮或干冰保存運(yùn)輸，效果較好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發(fā)均較快，適

21、于空運(yùn)，比較麻煩;二是充液法運(yùn)輸，比較簡(jiǎn)便。充液法運(yùn)輸操作如下： 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待達(dá)80%或90%匯合時(shí)，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液，量要達(dá)到培養(yǎng)瓶的頸部(過滿易污染)，保留少許空間，塞緊瓶塞，空氣過多運(yùn)輸中氣泡運(yùn)動(dòng)易使細(xì)胞脫落; 妥善包裝和運(yùn)送；一般在不超過四五天到達(dá)目的地的情況下，對(duì)細(xì)胞活力無嚴(yán)重影響; 到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留正常量，置37培養(yǎng)，次日傳代。25. 簡(jiǎn)述細(xì)胞污染的概念及種類.細(xì)胞污染: 凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物，都視為污染。組織培養(yǎng)污染: 微生物：真菌、細(xì)菌、支原體和病毒；化學(xué)物質(zhì)：影響細(xì)胞生存的非細(xì)胞所需的化學(xué)成分；細(xì)胞：不同細(xì)

22、胞類型的交叉污染。26. 細(xì)胞培養(yǎng)中污染主要通過哪些途徑，一般如何預(yù)防？空氣: 培養(yǎng)設(shè)施不宜置于通風(fēng)場(chǎng)所；定期清理凈化工作臺(tái)的過濾層，防止阻塞；操作中應(yīng)減少空氣流動(dòng)；帶口罩；夏季潮濕季節(jié)空氣中含菌數(shù)量多，每立方米內(nèi)含菌數(shù)不應(yīng)超過15個(gè)。清洗消毒：培養(yǎng)器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養(yǎng)用液滅菌不徹底等，都可引入有害物。操作：實(shí)驗(yàn)操作馬虎、動(dòng)作不準(zhǔn)確、消毒觀念不強(qiáng)，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口時(shí)不嚴(yán)，都可發(fā)生污染。同時(shí)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞，操作不慎使用同一吸管或培養(yǎng)用液，可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。血清：血清也是污染細(xì)胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測(cè)不嚴(yán)，常已被支原體和病毒污染。組織：初代培

23、養(yǎng)組織常有污染；有的是在手術(shù)中污染，有的本身可能是被污染的組織(如已發(fā)生潰爛的腫瘤組織)；手術(shù)用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染 。27 細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作要領(lǐng)及計(jì)算公式是什么？具體操作程序如下：取血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片，用75%酒精擦凈。將蓋玻片放于計(jì)數(shù)板上。用滴管取混合均勻的細(xì)胞懸液，滴入計(jì)數(shù)室內(nèi)。要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。滴加細(xì)胞懸液后約靜置1分鐘后則可以進(jìn)行計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，分別數(shù)出四角的四個(gè)大格（每個(gè)大格含有16個(gè)中格）中的細(xì)胞數(shù)。對(duì)壓邊線細(xì)胞：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右 計(jì)算：一般以每

24、毫升含細(xì)胞數(shù)來表示，大方格的面積為1mm2，室深為0.1mm，則體積為0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才為1ml體積。所以計(jì)算公式為：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml （ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×104 ×稀釋倍數(shù)；計(jì)數(shù)中，如果細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度過高，必須稀釋后再計(jì)；如果細(xì)胞數(shù)太少,可離心濃縮后再計(jì)。每個(gè)細(xì)胞懸液至少滴樣兩次求平均值。 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):不要漏計(jì)，不要重復(fù)細(xì)胞懸液應(yīng)混合均勻濃度不可過高也不可過低。28. 簡(jiǎn)述細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制過程及其應(yīng)用。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(cell growth curve)是觀測(cè)細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)，可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞增殖速度，確定細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存或具體實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間。它以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。 制作方法：培養(yǎng)細(xì)胞：首先在2孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞。計(jì)數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度。計(jì)數(shù)細(xì)胞密度：從接種時(shí)間算起，每隔24h計(jì)數(shù)孔內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。為提高準(zhǔn)確率，對(duì)每孔細(xì)胞可計(jì)數(shù)23次。如此操作至第七天結(jié)束。繪制曲線：以培養(yǎng)時(shí)間為