DotBlot檢測(cè)流程

1、第九章免疫學(xué)活性測(cè)定Dot blot 原理：原理：抗原抗體和受體配體結(jié)合可以被利用作蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單快速的定量 分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗體或者受體配體可以被標(biāo)記的 抗體識(shí)別并進(jìn)行定量記數(shù)形成定量分析方法的基礎(chǔ)。由于細(xì)胞培養(yǎng)需 要不斷監(jiān)測(cè)，工作量很大。因此快速簡(jiǎn)潔的定量分析是檢測(cè)細(xì)胞表達(dá) 水平監(jiān)測(cè)的重要手段。主要監(jiān)測(cè)方法包括Dot blot和ELISA。Dot blotDot blot是最快速簡(jiǎn)捷的方法之一，簡(jiǎn)述如下：在超凈臺(tái)內(nèi)，使 用無(wú)菌多孔加樣器將96孔板內(nèi)的細(xì)胞克隆培養(yǎng)液以5gL上樣量，成 排點(diǎn)于硝酸纖維素膜上并風(fēng)干，記錄好樣品順序（可在膜的正面邊緣 處標(biāo)記正面及名稱，也可通過(guò)在膜的右

2、下角剪去一角作為標(biāo)記，識(shí)別 膜的正反面及方向）。取上面風(fēng)干好的硝酸纖維素膜，用配制好的封 閉液（脫脂奶粉或白蛋白溶液）室溫震蕩孵育至少一小時(shí)。此步驟的 目的是封閉硝酸纖維素膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)，以避免下一步加入的抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合。將封閉好的硝酸纖維素膜浸泡在 第一抗體中，室溫震蕩孵育1小時(shí)，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后， 將膜浸泡到TTBS溶液中，室溫震蕩洗滌3次，每次5分鐘。將洗滌 后的硝酸纖維膜浸泡在含有酶標(biāo)第二抗體溶液中，室溫震蕩孵育1小時(shí)，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，將膜浸泡到TBST溶液中，室 溫震蕩洗滌3次，每次5分鐘。最后，將膜浸于熒光顯色劑（新鮮剛剛混合的等

3、量A和B液）。1-2分鐘后將浸泡過(guò)的膜，抖去多余顯色 劑，夾入保鮮膜（保鮮膜應(yīng)薄而透明，以免阻擋曝光效果）中，同時(shí) 觀察顯色情況，確定大致曝光時(shí)間（一般情況下，如果樣品亮度肉眼 可見且較強(qiáng)，那么初次曝光時(shí)間應(yīng)較短，一般選3-5秒；如果樣品亮度肉眼不可見，則初次曝光時(shí)間應(yīng)略長(zhǎng)一些，一般選擇1分鐘），曝光完畢，經(jīng)顯影，定影后，用清水沖洗 X光膠片，根據(jù)膠片上結(jié)果 情況，再將膜放入曝光暗盒中進(jìn)行二次曝光及顯影、定影反應(yīng)。溶液 配制及整個(gè)操作過(guò)程請(qǐng)斑點(diǎn)雜交操作流程圖。Dot blot需要TTBS溶解的倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照方能進(jìn)行半定量。 同時(shí)樣品倍比稀釋 也是半定量所必需。附1: Dot-Blot

4、操作流程圖以下均用微振搖床混和一、試劑1、抗待檢樣品抗體：第一抗體為純化鼠抗人IgG Fc 單抗； 第二抗體為HRP-兔抗小鼠IgG二抗。2、封閉液（5%脫脂奶粉）3、底物熒光顯色劑A、B4、TTBS（10 X ） 緩沖液：取三羥甲基氨基甲烷（Tris）60.5g, NaCl 45g ,吐溫-80 5.5ml ,加適量超純水溶解，用濃鹽酸（32ml）調(diào)PH7.5 ,補(bǔ)加超純水 至500ml。置于棕色瓶中，4 C保存，有效期6個(gè)月。用前10倍稀釋為1 X TTBS緩沖液。二、操作1、取硝酸纖維素膜1張，將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋、樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn) 在膜上，風(fēng)干。2、將膜置于封閉液（5%脫脂奶粉溶

5、于超純水中）室溫封閉1小時(shí)（也可4 C 過(guò)夜封閉）。3、棄去封閉液后，加入含有待檢樣品第一抗體的TTBS緩沖液30mL （抗體稀 釋度為1 : 1000 ）,且其中含有1%的脫脂奶粉，室溫震蕩孵育1小時(shí)。4、將硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液充分淋洗兩次，每次洗后都盡量棄去溶液。 然后再用TTBS緩沖液震蕩洗滌3次，每次5分鐘。5、棄去液體后，加入含有第二抗體的TTBS緩沖液30mL （抗體稀釋度為1 : 2000 ）,室溫震蕩孵育1小時(shí)。6、將硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液充分淋洗兩次，每次洗后都盡量棄去溶液。 然后再用TTBS緩沖液震蕩洗滌3次，每次5分鐘。7、取出硝酸纖維素膜，略除去膜上多余溶

6、液后，加入適量的熒光顯色劑A、B （一般1/2張96孔板大小的膜加4mLA、B混合液，且A液：B液=1 : 1）。8、用保鮮膜將硝酸纖維素膜覆蓋，盡量平整，避免產(chǎn)生氣泡，并放在曝光夾 上，根據(jù)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的亮度，初步確定曝光時(shí)間（一般情況下，如果樣品亮度 肉眼可見且較強(qiáng)，那么初次曝光時(shí)間應(yīng)較短，一般選 3-5秒；如果樣品亮度肉眼不可見，則初次曝光時(shí)間應(yīng)略長(zhǎng)一些，一般選擇1分鐘），然后取適 當(dāng)大小的膠片覆蓋在薄膜上，關(guān)夾曝光。8、曝光后，取出膠片浸于顯影液中， 在紅光下觀察，直到膠片上的樣品點(diǎn)不再變化為止（1.5分鐘），取出膠片在水中涮洗一下（此步驟避免顯影液與定影液混合，降低定影液使用 效率）

7、，再放入定影液中，當(dāng)膠片本底呈現(xiàn)藍(lán)色透明后，即可取出膠片進(jìn)行流水沖洗， 洗凈后晾干即可。此實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)：（1）在整個(gè)操作過(guò)程中，手不能直接接觸硝酸纖維素膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解；（2）脫脂奶粉封避一定要充分，否則容易造成膜與蛋白的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)果片中出 現(xiàn)雜點(diǎn)或假陽(yáng)性，干擾試驗(yàn)結(jié)果。（3）一抗?jié)舛扰c二抗?jié)舛炔灰诉^(guò)高，否則容易造成高背景或者雜點(diǎn)。適宜濃度的選擇，可 以通過(guò)不同濃度組合的預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行確定。（4） 暗室一定要確保其不漏光，否則容易造成X光片跑光，整個(gè)光片全黑的情況。（5）曝光時(shí)，時(shí)間的確定應(yīng)該具體情況具體分析，需要一定的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)積累。ELISA1、雙抗體夾心法：本法適用

8、于樣品含量低靈敏度要求高的定量分析， 簡(jiǎn)述如下。先用選定的第一抗體（單抗原結(jié)合點(diǎn)的單抗為首選）在堿 性條件下（一般PH=8.08.5碳酸鹽緩沖液）包裹96孑板，置4C過(guò) 夜或者室溫1小時(shí)。然后用排槍或真空吸管吸出一抗，再用 BSA或 稀釋的奶粉封閉45至60分鐘。封閉后用洗滌液洗板2次。加入待測(cè) 抗原樣品（條件培養(yǎng)液）和標(biāo)準(zhǔn)品（PBS稀釋）。用洗滌液洗板2次。 加入標(biāo)記好的相應(yīng)抗體室溫1小時(shí)。用洗滌液洗板2次。如果不是標(biāo) 記的抗體，可再用標(biāo)記的抗一抗抗體（二抗）重復(fù)以上步驟再加入底物 液顯色和上機(jī)讀數(shù)。2、間接法：適用于靈敏度要求低，樣品含量高的分析方法，步驟如 下。將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，加

9、至 96孔酶標(biāo)板，置4C過(guò)夜，或室 溫放置3小時(shí)。用洗滌液PBS-T配制的1%BSA溶液加至板內(nèi)，37C 放置1小時(shí)。將封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗板 2次。將一抗加至板內(nèi)， 同時(shí)加入兩孔空白對(duì)照（稀釋液），37 C放置1小時(shí)。用稀釋液稀釋 HRP酶標(biāo)記的第二抗體加至板內(nèi)，37C放置1小時(shí)。用洗滌液洗板2 次。加入底物液顯色和上機(jī)讀數(shù)。注：終止液可加可不加。3、結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)法：放射免疫法是典型的競(jìng)爭(zhēng)法。它利用同位素標(biāo)記抗原（I-125）與非標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。非標(biāo)記抗原或者樣品中的 抗原越多標(biāo)記的抗原（I-125）與抗體結(jié)合的越少。一定濃度的 PEG 可以沉淀抗體結(jié)合的標(biāo)記的抗原（即抗原-抗體復(fù)合物

10、），但不可以 沉淀游離的抗體或抗原（即非結(jié)合的抗原或者抗體）。沉淀的抗原 - 抗體復(fù)合物離心后吸出上清中的非結(jié)合的抗原或者抗體可以經(jīng)過(guò)放 射性計(jì)數(shù)定量。標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的待測(cè)抗原越少計(jì)數(shù)越高。根據(jù)這個(gè)道理可以畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線和查出相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原含量。此法靈敏度高于其它方法，可達(dá)到10-100pg/ml水平，適用于血漿和組織藥物濃 度的動(dòng)力學(xué)研究（藥物PK study）。4、新方法的建立原則1）以上所有方法的建立主要取決于抗體質(zhì)量的好壞，因此多試幾個(gè)商品化的抗體有必要。2)般情況下，先決定所測(cè)樣本中抗原量的最低和最高限度,即測(cè)定范圍。原則上要求抗原和抗體的濃度等量，比如新方法要求檢測(cè)抗原濃度在11

11、0mg/L范圍內(nèi)，靈敏度要求是1mg/ml，最高濃度 10 mg/ml，高于10 mg/ml使用樣品倍比稀釋的方法來(lái)解決。此時(shí)， 檢測(cè)抗原濃度在1mg/L,假設(shè)需要100%抗原抗體結(jié)合的有效抗體稀 釋度為1: 8000,又假設(shè)需要100%抗原抗體結(jié)合的有效抗體稀釋度 為1: 4000。因此決定此法有效抗體稀釋度在 1: 8000到1: 4000 之間。我們的結(jié)論是一般情況下抗原的濃度降低則抗體的相對(duì)濃度也 降低。如果想提高方法的抗原探測(cè)靈敏度，一般使用相對(duì)低濃度的抗體。如果想降低方法的抗原探測(cè)靈敏度，一般使用相對(duì)高濃度的抗體。3） 分析方法的變異范圍（代表可靠程度）一般用CV （Coeffic

12、ient variant）來(lái)計(jì)算。CV=SD （標(biāo)準(zhǔn)差）/X（平均值）X100%。一般批內(nèi)（intra-assa的CV要小于批間（inter-assay）的CV。例如N 個(gè)（N至少要大于6）同一代測(cè)標(biāo)本在一次方法分析中相差會(huì)很小，即CV很?。–V=5-10%可以接受）。又如N個(gè)同一代測(cè)標(biāo)本在多次 方法分析中相差會(huì)很大，即 CV很大（CV=10-30%可以接受）。批內(nèi) 和批間變異是最常用的定量分析控制方法。一般低溫（-30 C或以上） 長(zhǎng)期貯存的質(zhì)量控制用標(biāo)準(zhǔn)品在每次方法分析中都要使用， 這就是常 用的定量分析方法的質(zhì)量控制。附：?jiǎn)慰寺】贵w制備原理單克隆抗體的制備過(guò)程包括經(jīng)典的細(xì)胞克隆化步驟理解

13、單克隆抗體的制備不但有助于理解細(xì)胞克隆化的方法，還有助于理解分析方 法中抗體的選用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將一定濃度的抗原免疫小鼠，取小鼠脾臟，無(wú)菌磨碎， 取懸浮的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞在體外在一定濃度PEG的作用下（PEG可將2個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合在一起）融合形成雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò) HAT培養(yǎng)液在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中篩選，死亡者為未融合的小鼠骨髓 瘤細(xì)胞（HAT培養(yǎng)液可殺死小鼠骨髓瘤細(xì)胞）和不能傳代生長(zhǎng)的小 鼠脾臟細(xì)胞（高度分化細(xì)胞不能傳代生長(zhǎng)）。幸存者（即可在HAT培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的細(xì)胞）為融合的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞具有小鼠脾 臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞共同的特性，因此可以在HAT培養(yǎng)液中傳代生長(zhǎng)。使用簡(jiǎn)單的抗體抗原結(jié)合的方法可以測(cè)定 96孔板中每孔中雜交 瘤細(xì)胞的抗體分泌量。選出分泌量最高的雜交瘤進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增， 再克 隆，鑒定抗體的類型和親和力，IgG為首選。以上就是單克隆抗體制 備的簡(jiǎn)單過(guò)程。附：多克隆抗體制備原理將一定濃度的抗原免疫大鼠或兔羊馬的起初產(chǎn)生的免疫球蛋白為IgA IgM,后期大量產(chǎn)生IgG, IgG可分為IgGi I