細菌的分離培樣及鑒定PPT課件

1、一、細菌分離培養(yǎng)一、細菌分離培養(yǎng)第1頁/共27頁1、需氧菌的分離鑒定、需氧菌的分離鑒定 細菌分離培養(yǎng)一般采取細菌分離培養(yǎng)一般采取“劃線法劃線法”，主要有分區(qū)劃線，十字交叉劃線，主要有分區(qū)劃線，十字交叉劃線等方法，具體方法可按照個人習慣選擇應用，目的是達到使被檢材料適當?shù)确椒ǎ唧w方法可按照個人習慣選擇應用，目的是達到使被檢材料適當?shù)南♂?，以達到獲得獨立單在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鑒別其菌的稀釋，以達到獲得獨立單在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鑒別其菌落性狀。落性狀。第2頁/共27頁幾種常見的劃線方法第3頁/共27頁劃線步驟第4頁/共27頁第5頁/共27頁操作方法： 1 1、左手持平皿，用

2、左手的拇指、食指和中指將平皿、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指將平皿蓋揭開呈蓋揭開呈2020左右的角度；左右的角度； 2 2、右手持接種環(huán)，從混合培養(yǎng)物中沾取少許混合物、右手持接種環(huán)，從混合培養(yǎng)物中沾取少許混合物涂布在培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)多余的混合物在火焰涂布在培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)多余的混合物在火焰中燒灼，待冷卻后，再與所涂混合物的地方輕觸，在空中燒灼，待冷卻后，再與所涂混合物的地方輕觸，在空白區(qū)劃線，后再燒灼，冷卻后再在空白區(qū)劃線，反復操白區(qū)劃線，后再燒灼，冷卻后再在空白區(qū)劃線，反復操作，直至混合物稀釋到足夠形成單菌落。作，直至混合物稀釋到足夠形成單菌落。第6頁/共27頁注意事項

3、：A A 劃線前先將接種環(huán)稍彎曲，使其和平皿內(nèi)瓊脂面平行，劃線前先將接種環(huán)稍彎曲，使其和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致于劃破培養(yǎng)基。不致于劃破培養(yǎng)基。B B 劃線中盡量不要重復、往復劃線，以免形成菌苔。劃線中盡量不要重復、往復劃線，以免形成菌苔。C C 劃線接種完畢，在平皿底部寫上菌名、日期和接種者劃線接種完畢，在平皿底部寫上菌名、日期和接種者等標記，然后倒扣培養(yǎng)等標記，然后倒扣培養(yǎng)。第7頁/共27頁2、厭氧分離培養(yǎng)、厭氧分離培養(yǎng)1 1、接種方法與需氧菌分離接種方法相同，僅培養(yǎng)條件發(fā)生變化。、接種方法與需氧菌分離接種方法相同，僅培養(yǎng)條件發(fā)生變化。2 2、厭氧培養(yǎng)方法主要有：二氧化碳厭氧法、生物學方法、

4、化學方法、物理、厭氧培養(yǎng)方法主要有：二氧化碳厭氧法、生物學方法、化學方法、物理學方法等。學方法等。第8頁/共27頁 二氧化碳厭氧法：二氧化碳厭氧法：* * 簡單的二氧化碳培養(yǎng)法可在盛放有培養(yǎng)物的有蓋玻璃簡單的二氧化碳培養(yǎng)法可在盛放有培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi)，燃點蠟燭，蓋上玻璃缸蓋，當火焰熄滅時，該缸缸內(nèi)，燃點蠟燭，蓋上玻璃缸蓋，當火焰熄滅時，該缸內(nèi)空氣二氧化碳濃度大約增加了內(nèi)空氣二氧化碳濃度大約增加了5%5%10%10%。* * 化學方法生成二氧化碳，碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫化學方法生成二氧化碳，碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。* * 現(xiàn)在實驗室

5、設備中，已有二氧化碳培養(yǎng)箱，只需把二現(xiàn)在實驗室設備中，已有二氧化碳培養(yǎng)箱，只需把二氧化碳的濃度設置成所需濃度即可達到相應的厭氧環(huán)境。氧化碳的濃度設置成所需濃度即可達到相應的厭氧環(huán)境。第9頁/共27頁 生物學方法：生物學方法：* * 原理：利用培養(yǎng)基中含有的植物或動物組織消耗氧氣原理：利用培養(yǎng)基中含有的植物或動物組織消耗氧氣的原理制成。植物或動物的組織具有呼吸作用，組織中的原理制成。植物或動物的組織具有呼吸作用，組織中的可氧化物質(zhì)也可以消耗培養(yǎng)基中的氧氣。的可氧化物質(zhì)也可以消耗培養(yǎng)基中的氧氣。* * 植物組織包括馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等；植物組織包括馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等；* * 動物組織包括

6、新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、動物組織包括新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等。心、腦等。* * 目前比較常用的有厭氣肉肝湯培養(yǎng)基、碎肉培養(yǎng)基等目前比較常用的有厭氣肉肝湯培養(yǎng)基、碎肉培養(yǎng)基等。第10頁/共27頁 化學方法：化學方法：* * 原理：利用還原性比較強的物質(zhì)將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基原理：利用還原性比較強的物質(zhì)將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收。內(nèi)的氧氣吸收。* * 連二亞硫酸鈉、碳酸鈉和氧氣反應生成硫酸鈉、亞硫連二亞硫酸鈉、碳酸鈉和氧氣反應生成硫酸鈉、亞硫酸鈉和二氧化碳，消耗環(huán)境中的氧氣；酸鈉和二氧化碳，消耗環(huán)境中的氧氣；* * 每每100100立方厘米空間用立方厘米空間用1g1

7、g焦性沒食子酸及焦性沒食子酸及10ml 10%10ml 10%氫氫氧化鈉或氫氧化鉀，焦性沒食子酸在堿性溶液中吸收大氧化鈉或氫氧化鉀，焦性沒食子酸在堿性溶液中吸收大量氧氣，生成焦性沒食橙。量氧氣，生成焦性沒食橙。第11頁/共27頁 物理學方法：物理學方法：* * 原理：利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅(qū)除原理：利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧環(huán)境，利或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧環(huán)境，利于厭氧菌的生長。于厭氧菌的生長。* * 常用的方法有厭氧罐法、真空干燥器法、高層瓊脂法、常用的方法有厭氧罐法、真空干燥器法、高層瓊脂法、加熱密封法等。

8、加熱密封法等。第12頁/共27頁3、純培養(yǎng)與移植、純培養(yǎng)與移植* *培養(yǎng)皿接種到斜面、單菌落接種到增菌肉湯、穿刺培養(yǎng)。培養(yǎng)皿接種到斜面、單菌落接種到增菌肉湯、穿刺培養(yǎng)。 培養(yǎng)皿接種到斜面：右手執(zhí)無菌接種棒，無菌條件下，培養(yǎng)皿接種到斜面：右手執(zhí)無菌接種棒，無菌條件下，左手打開平皿蓋，用接種環(huán)挑取單菌落，立即取瓊脂斜左手打開平皿蓋，用接種環(huán)挑取單菌落，立即取瓊脂斜面小管，將管口火焰滅菌。右手小指夾住管塞拔出，將面小管，將管口火焰滅菌。右手小指夾住管塞拔出，將接種針深入到待接小管中，從斜面底部開始劃曲線，從接種針深入到待接小管中，從斜面底部開始劃曲線，從下至上直至斜面頂端為止。管口通過火焰滅菌后，蓋

9、好下至上直至斜面頂端為止。管口通過火焰滅菌后，蓋好管塞。最后標注菌名、時間和接種者，置適宜條件培養(yǎng)。管塞。最后標注菌名、時間和接種者，置適宜條件培養(yǎng)。* *單菌落移植到肉湯培養(yǎng)基中增菌：挑取單菌落過程如上單菌落移植到肉湯培養(yǎng)基中增菌：挑取單菌落過程如上所述，接種到肉湯小管內(nèi)，置于適宜條件培養(yǎng)。所述，接種到肉湯小管內(nèi)，置于適宜條件培養(yǎng)。* *穿刺培養(yǎng)：半固體移植采用穿刺法接種，方法基本與純穿刺培養(yǎng)：半固體移植采用穿刺法接種，方法基本與純培養(yǎng)接種相同，差別在用接種針挑取單菌落，垂直刺入培養(yǎng)接種相同，差別在用接種針挑取單菌落，垂直刺入培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)基內(nèi)。第13頁/共27頁注意事項：A A 接種環(huán)（針

10、）火焰燒灼滅菌后要稍冷卻后再挑取菌落；接種環(huán)（針）火焰燒灼滅菌后要稍冷卻后再挑取菌落；B B 打開平皿，接種過程保持無菌狀態(tài)，盡量靠近酒精燈打開平皿，接種過程保持無菌狀態(tài)，盡量靠近酒精燈燃心；燃心；C C 接種后，培養(yǎng)小管或平板要置于適宜條件，利于細菌接種后，培養(yǎng)小管或平板要置于適宜條件，利于細菌生長；生長；D D 穿刺培養(yǎng)，接種針要直刺直出，不要反復戳刺；穿刺培養(yǎng)，接種針要直刺直出，不要反復戳刺；E E 芽孢菌耐殺滅，培養(yǎng)芽孢菌的實驗室最好單獨使用，芽孢菌耐殺滅，培養(yǎng)芽孢菌的實驗室最好單獨使用，否則要徹底滅菌。否則要徹底滅菌。第14頁/共27頁二、細菌抹片的制備及染色二、細菌抹片的制備及染色

11、第15頁/共27頁1、細菌染色原理、細菌染色原理 由于細菌細胞結(jié)構(gòu)和化學成分不同，因此具由于細菌細胞結(jié)構(gòu)和化學成分不同，因此具有毛細管、滲透、吸附和吸收等物理作用及離子交有毛細管、滲透、吸附和吸收等物理作用及離子交換、酸堿親和等化學作用。換、酸堿親和等化學作用。 利用各種染料對細菌細胞產(chǎn)生的各種物理、利用各種染料對細菌細胞產(chǎn)生的各種物理、化學作用，使其著色情況具有差異，便于鏡檢觀察化學作用，使其著色情況具有差異，便于鏡檢觀察。第16頁/共27頁2、細菌抹片的制備、細菌抹片的制備 A A 玻片準備：用玻片準備：用95%95%酒精浸泡或滴酒精浸泡或滴95%95%酒精酒精2 23 3滴，用潔凈紗布擦

12、拭，然滴，用潔凈紗布擦拭，然后在酒精燈外焰上拖過幾次，若油漬比較頑固，可滴后在酒精燈外焰上拖過幾次，若油漬比較頑固，可滴1 12 2滴冰醋酸，用紗滴冰醋酸，用紗布擦拭后，在酒精燈外焰上拖過幾次。處理過的載玻片應清晰透明，潔凈布擦拭后，在酒精燈外焰上拖過幾次。處理過的載玻片應清晰透明，潔凈而無油漬，滴上水后能均勻展開，附著性好。而無油漬，滴上水后能均勻展開，附著性好。第17頁/共27頁B B 抹片：抹片：液體材料：如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等，可液體材料：如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等，可直接用滅菌接種環(huán)沾取一環(huán)材料，在載玻片中央均勻涂直接用滅菌接種環(huán)沾取一環(huán)材料，在載玻片中央均勻涂布

13、成適當大小的薄層。布成適當大小的薄層。非液體材料：如菌落、膿、糞便等，現(xiàn)用接種環(huán)取少量非液體材料：如菌落、膿、糞便等，現(xiàn)用接種環(huán)取少量生理鹽水置于載玻片中央，然后在用滅菌接種環(huán)沾取少生理鹽水置于載玻片中央，然后在用滅菌接種環(huán)沾取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當大小的薄層。量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當大小的薄層。組織臟器材料：可先用鑷子夾持中部，然后用滅菌剪刀組織臟器材料：可先用鑷子夾持中部，然后用滅菌剪刀剪去一小塊，用其新鮮切面在載玻片上壓印或涂抹成一剪去一小塊，用其新鮮切面在載玻片上壓印或涂抹成一薄層。薄層。第18頁/共27頁C C 干燥：一般采取自然干燥法。干燥：一般采取自然

14、干燥法。D D 固定：火焰固定和化學固定固定：火焰固定和化學固定火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精燈外火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精燈外焰上來回擺動幾次，略加熱，但不能太熱，不燙手為宜。焰上來回擺動幾次，略加熱，但不能太熱，不燙手為宜?；瘜W固定：血液、組織臟器的抹片做姬姆薩染色不用火化學固定：血液、組織臟器的抹片做姬姆薩染色不用火焰固定用甲醇固定。將已干燥的抹片浸入甲醇中焰固定用甲醇固定。將已干燥的抹片浸入甲醇中2 23min3min，自然揮發(fā)干燥。，自然揮發(fā)干燥。第19頁/共27頁3、細菌染色方法、細菌染色方法染色方法主要有革蘭染色法、美藍染色法、抗酸染色法、瑞氏染色

15、法和姬染色方法主要有革蘭染色法、美藍染色法、抗酸染色法、瑞氏染色法和姬姆薩染色法。姆薩染色法。以下以革蘭染色法為例簡要介紹操作方法。以下以革蘭染色法為例簡要介紹操作方法。第20頁/共27頁革蘭染色法：革蘭染色法：* * 原理：機理仍不清楚，一般認為與細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)原理：機理仍不清楚，一般認為與細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學成分有關(guān)。和化學成分有關(guān)。 革蘭陰性菌細胞壁含有較多的脂類，當以革蘭陰性菌細胞壁含有較多的脂類，當以95%95%酒精脫色酒精脫色時，脂類被溶去，使細胞壁孔隙變大，盡管酒精處理能時，脂類被溶去，使細胞壁孔隙變大，盡管酒精處理能使肽聚糖孔隙變小，但因為肽聚糖含量較小，細胞壁收使肽聚糖孔

16、隙變小，但因為肽聚糖含量較小，細胞壁收縮有限，故能讓結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復合物被酒縮有限，故能讓結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復合物被酒精洗脫出細胞壁之外，而被后來紅色的復染劑染成紅色。精洗脫出細胞壁之外，而被后來紅色的復染劑染成紅色。 革蘭陽性菌細胞壁所含脂類少，肽聚糖多，酒精脫色時，革蘭陽性菌細胞壁所含脂類少，肽聚糖多，酒精脫色時，細胞壁孔隙縮小到不易讓結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復細胞壁孔隙縮小到不易讓結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復合物洗出細胞壁外，而被染成紫色。合物洗出細胞壁外，而被染成紫色。第21頁/共27頁操作方法：操作方法：1 1、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，、在已干燥

17、、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，1 12min2min后，水洗；后，水洗；2 2、滴加革蘭氏碘溶液于抹片媒染，作用、滴加革蘭氏碘溶液于抹片媒染，作用1 13min3min后，水后，水洗；洗；3 3、滴加、滴加95%95%酒精于抹片上脫色，作用酒精于抹片上脫色，作用202030s30s，水洗；，水洗；4 4、滴加沙黃水溶液或石炭酸復紅溶液復染、滴加沙黃水溶液或石炭酸復紅溶液復染1min1min，水洗；，水洗；5 5、用吸水紙吸干或自然干燥，鏡檢；、用吸水紙吸干或自然干燥，鏡檢；6 6、結(jié)果，革蘭陽性菌呈藍紫色，革蘭陰性菌呈紅色、結(jié)果，革蘭陽性菌呈藍紫色，革蘭陰性菌呈紅色。第22頁/共27

18、頁注意事項注意事項A A 制作抹片固定時溫度不能過高，溫度過高會使細胞壁中蛋白變性，染色制作抹片固定時溫度不能過高，溫度過高會使細胞壁中蛋白變性，染色中染液的滲出會有影響；中染液的滲出會有影響；B B 革蘭染色法中，酒精濃度不能過高，也不能過低。此外，酒精脫色時間革蘭染色法中，酒精濃度不能過高，也不能過低。此外，酒精脫色時間不宜過長，不要超過不宜過長，不要超過30s30s；C C 瑞氏染色法中，由于染料中有沉淀，所以要避免沉淀附著在抹片上影響瑞氏染色法中，由于染料中有沉淀，所以要避免沉淀附著在抹片上影響鏡檢觀察；鏡檢觀察；D D 染色水洗，水盡量用蒸餾水，水的流速不要過大，防止將細菌洗脫染色水洗，水盡量用蒸餾水，水的流速不要過大，防止將細菌洗脫