TheMIQEGuidelines-MIQE指南

1、鐘藝2014.12.15MIQE指南：發(fā)表實時熒光定量PCR實驗所需提供的最低信息量背景 缺乏共識 細節(jié)不夠目的 使作者能夠設(shè)計和報告更有價值的qPCR實驗。 使評閱人員和編輯按照相應(yīng)的標準來評價所提交的文稿的技術(shù)質(zhì)量。 使讀者更容易重復(fù)按照該指南發(fā)表的實驗研究。學(xué)術(shù)術(shù)語 qPCR實時定量PCR（Quantitative Real-time PCR） RT PCR反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Reaction PCR） 標準化基因參照基因（reference genes） TaqMan探針水解探針（Hydrolysis Probes） FRET探針熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針 LightCycler型

2、探針雙雜交探針 定量quantification 循環(huán)數(shù)Cq（quantification cycle）概念 分析靈敏度：單次分析中能夠準確測定的樣本的最小拷貝數(shù)（濃度），區(qū)別于臨床靈敏度。 分析特異性：qPCR分析在樣本中有其他物質(zhì)存在時只檢測目標序列的能力。區(qū)別于診斷特異性。 準確度：實驗測定濃度與實際濃度的差異，以差異倍數(shù)和拷貝數(shù)的估計值表示。 重復(fù)性（短期/批內(nèi)）：同一方法分析同一樣本的精密度和耐用性，Cq的變異。 重現(xiàn)性（長期/批間）：批間結(jié)果或不同實驗室間結(jié)果的變異，拷貝數(shù)的變異。 描述目標基因mRNA濃度：RT-PCR分析+引物序列信息、引物相對于特定剪接變異體的特異性評價信息、

3、有文件證明的轉(zhuǎn)錄過程中單核苷酸多態(tài)性的位置信息、使用的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫。（RTprimerDB） mRNA濃度 蛋白濃度研究和診斷 研究樣本：來源廣泛、低通量、樣品類型不同 診斷樣本：數(shù)量有限、高通量、樣品類型少樣本的采集、處理和制備 待測目標為RNA組織樣本的采集來源、是否立即處理、保存時間、保存條件； 簡單描述樣本：腫瘤顯微鏡活檢活檢標本中腫瘤細胞組成的百分比。 核酸提?。禾崛》椒?、測定濃度的方法、質(zhì)量評價方法核酸的質(zhì)量控制RNA樣本 RNA樣本：保證各樣本中含有大致相同量的RNA 檢測和報告全基因組DNA的污染程度 RNA樣品是否已經(jīng)過RNA酶處理（酶類型及反應(yīng)條件） 核酸目標在陽性

4、質(zhì)控品和NTC下Cq值的比較 RNA模板的質(zhì)量評價數(shù)量、污染情況、完整度 A260/280中性PH的緩沖鹽 測定mRNA濃度微?。?0X）差異：凝膠電泳 DNA樣本：陽性質(zhì)控檢測抑制作用反轉(zhuǎn)錄 實驗方案和試劑 RNA量、引物、酶的類型、酶的用量、溫度、反應(yīng)時間 23次重復(fù)（相同RNA濃度）qPCR 每個目的基因和對照基因的數(shù)據(jù)庫檢索編號 每個引物和探針的外顯子位置 寡核苷酸的序列和濃度（染料或被修飾的堿基的性質(zhì)、位置和連接） 聚合酶的濃度和性質(zhì) 模板DNA或cDNA的量 鎂離子的濃度 緩沖鹽的化學(xué)組成（鹽、PH值和添加劑）及反應(yīng)體積 qPCR儀和循環(huán)條件 器材制造商 塑料器皿透明度（白色/透明

5、） 密封方式（熱合/粘合）qPCR 二級結(jié)構(gòu)：mfold 特異性：BLAST，驗證（電泳凝膠、解鏈曲線圖形、DNA測序） 引物優(yōu)化：退火溫度和鎂離子梯度、Cq值、熒光點數(shù)對比循環(huán)次數(shù)和溶解曲線 質(zhì)控品和定量校準品：每一塊反應(yīng)板都要有NTC并確立數(shù)據(jù)排除標準 分析性能：PCR的效率校準曲線法（斜率、Y軸截距） 線性動態(tài)范圍平均校準曲線法，動態(tài)范圍至少跨越3個數(shù)量級，濃度范圍達到56個log10濃度，線性區(qū)間包括目標核酸的定量范圍，報告最低濃度的變異與相關(guān)系數(shù)（R2值），提供整個線性動態(tài)范圍內(nèi)的CI（可信區(qū)間）值。 檢測限：能夠檢測到95%的陽性標本的最低濃度。 精密度：進行多次重復(fù)測定，并標示重

6、復(fù)性（SD）和可信區(qū)間。對于診斷分析還需報告不同地點和不同操作者的批間精密度（重現(xiàn)性）。 多重qPCR：需證明在多重PCR下的分析效率及LOD與單一PCR反應(yīng)下相同。數(shù)據(jù)分析 提供數(shù)據(jù)分析方法和置信限評估的詳細信息及分析軟件的性能指標。 標準化：參考基因的選擇優(yōu)化及最佳數(shù)量 不提倡采用單一參考基因，除非能證明其在所述實驗條件下沒有表達差異。 報告目的基因參考基因mRNA濃度的比值，參考基mRNA應(yīng)該有穩(wěn)定表達，且豐度與樣本中mRNA總量有較強相關(guān)性。 生物系統(tǒng)固有變異：大量樣本以增加統(tǒng)計學(xué)意義。 質(zhì)量分析：定性PCR也需要提供其分析性能的詳細內(nèi)容（線性動態(tài)范圍和檢測限）?？偨Y(jié)項目項目必要必要非

7、必要非必要實驗設(shè)計實驗組和對照組的定義各組組內(nèi)編號研究者所在實驗室致謝樣品采樣方式處理過程（是否冰凍/固定）儲存條件及時間樣品體積與質(zhì)量核酸提取提取方法和儀器及試劑盒名稱DNA酶和RNA酶處理的細節(jié)DNA或RNA污染核酸含量及測定方法和儀器RNA完整性及測定方法和儀器PCR抑制性檢測（樣本稀釋法）添加劑來源核酸純度（A260/A280）核酸產(chǎn)量電泳結(jié)果逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件RNA量和反應(yīng)體系引物及其濃度逆轉(zhuǎn)錄酶及其濃度溫度和時間試劑制造商及目錄編號cDNA的儲存總結(jié)項目項目必要必要非必要非必要qPCR目的基因信息基因標志序列登陸號擴增子長度軟件的特異性篩選（BLAST）各引物的外顯子或內(nèi)含子位置擴增子

8、位置假基因，反轉(zhuǎn)錄假基因，同系物序列比對擴增子的二級結(jié)構(gòu)分析針對什么剪接體qPCR引物引物序列所有結(jié)合位點RTPrimerDB中的識別號探針序列引物制造商純化方法qPCR程序完整的反應(yīng)條件及熱循環(huán)參數(shù)反應(yīng)體積和模板量引物（探針），Mg2+，dNTP濃度聚合酶識別位點及其濃度緩沖液或試劑盒制造商添加劑（SYBR Green I，DMSO等）qPCR儀儀器制造商緩沖液的化學(xué)成分反應(yīng)管/板的商品編號及制造商PCR循環(huán)方式（手動/自動）總結(jié)項目項目必要必要非必要非必要qPCR驗證特異性（凝膠電泳、測序、溶解曲線、酶切）NTC的Cq校準曲線的斜率、截距和R2值PCR擴增效率線性動態(tài)范圍LOD的測定Cq值變化多重PCR每次測定的LOD和效率優(yōu)化證據(jù)（梯度）數(shù)據(jù)分