蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能ppt課件

1、第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)的分子組成第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)分離與純化的基本原理蛋白質(zhì)分離與純化的基本原理一、什么是蛋白質(zhì)？一、什么是蛋白質(zhì)？ 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸（是由許多氨基酸（amino acid)通過肽通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物。鍵相連形成的高分子含氮化合物。二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性1. 蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分 占人體干重占人體干重45%，細(xì)胞

2、，細(xì)胞70%2. 蛋白質(zhì)具有多樣性的生物學(xué)功能蛋白質(zhì)具有多樣性的生物學(xué)功能 1）作為生物催化劑）作為生物催化劑 enzyme 2）代謝調(diào)節(jié)功能）代謝調(diào)節(jié)功能 hormone 3）免疫保護(hù)功能免疫保護(hù)功能 Ab 4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存功能）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存功能 binding-component 5）運(yùn)動(dòng)與支持）運(yùn)動(dòng)與支持 6）參與細(xì)胞間信息傳遞）參與細(xì)胞間信息傳遞一、蛋白質(zhì)的元素組成一、蛋白質(zhì)的元素組成1、主要元素：、主要元素：碳碳（50%55%）、）、氫氫（6%8%）、）、氧氧（19%24%）、）、氮氮（13%19%）；）； 次要元素：硫、磷、鐵、錳、鋅、碘。次要元素：硫、磷、鐵、錳、鋅、碘。

3、2、蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)、蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn) 基于：各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近：平均為基于：各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近：平均為16%； 體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主。體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主。 則可通過則可通過 測測N 測測Pr。即每克樣品蛋白質(zhì)的含量即每克樣品蛋白質(zhì)的含量=每克樣品的含氮量每克樣品的含氮量6.25二、組成蛋白質(zhì)的基本單位二、組成蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸氨基酸(amino acids)1、氨基酸（、氨基酸（AA）的通式的通式 H R C COOH -氨基和氨基和-羧基羧基 NH22、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：（1）20種基本氨基酸中，除脯氨酸為亞氨基酸外，其余種基本氨基酸中，除脯氨酸為亞氨基酸

4、外，其余19種均符合通式；種均符合通式；（2）除甘氨酸的）除甘氨酸的R基為基為H外，其余外，其余19種種-碳原子為不對稱碳原子，有碳原子為不對稱碳原子，有L、 D型之分，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸均為型之分，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸均為L型；型；（3）不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)不同。）不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)不同。3、氨基酸的分類、氨基酸的分類（根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同）（根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同） （1）非極性疏水性）非極性疏水性AA：R為疏水基團(tuán)，無極性。為疏水基團(tuán)，無極性。 Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Trp 8種種（2）極性中性）極性中性AA：R不帶電荷，但顯極

5、性。不帶電荷，但顯極性。 Gly、Ser、Thr、Tyr、 Cys、 Asn、Gln7種種（3）酸性）酸性AA：R可電離帶負(fù)電荷，有極性。可電離帶負(fù)電荷，有極性。 Glu、Asp2種種（4）堿性）堿性AA：R可電離帶正電荷，有極性?？呻婋x帶正電荷，有極性。 Lys、Arg、His3種種4. 蛋白質(zhì)中少見的氨基酸蛋白質(zhì)中少見的氨基酸羥脯氨酸、羥賴氨酸、四碘鉀腺原氨酸（甲狀腺素、羥脯氨酸、羥賴氨酸、四碘鉀腺原氨酸（甲狀腺素、T4）胱氨酸胱氨酸NHHOCOOH4-羥基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羥基賴氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基賴

6、氨酸HOIICH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫鍵二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-HS-CH2-CH-COO-+NH35. 非蛋白質(zhì)氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸-丙氨酸、丙氨酸、D-苯丙氨酸、同型半胱氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、同型半胱氨酸、鳥氨酸、-氨基丁酸氨基丁酸三、氨基酸的性質(zhì)三、氨基酸的性質(zhì)1、兩性電離性質(zhì)、兩性電離性質(zhì)pH = pI 凈電荷凈電荷=0

7、pH pI凈電荷為負(fù)凈電荷為負(fù)CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+ + H+ OH- + H+ OH-(pK 1)(pK 2) 當(dāng)氨基酸溶液在某一當(dāng)氨基酸溶液在某一pH值時(shí)，其所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，值時(shí)，其所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的在電場中既不向陽極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值就稱為該氨基酸的值就稱為該氨基酸的等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point)。等電點(diǎn)等電點(diǎn)使某種氨基酸所帶正、負(fù)電荷數(shù)相等時(shí)溶液的使某種氨基酸所帶正、負(fù)電荷數(shù)相等時(shí)溶液的PH值。值。 2、紫外吸收特性、紫外吸收特性 A280n

8、m 3、茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)：可做氨基酸的定性、定量測定。：可做氨基酸的定性、定量測定。一、多肽的結(jié)構(gòu)一、多肽的結(jié)構(gòu)1、肽鍵與肽、肽鍵與肽肽鍵肽鍵(peptide bond)：由一個(gè)由一個(gè)AA的的-氨基與另一個(gè)氨酸的氨基與另一個(gè)氨酸的 -羧基脫水縮合生成的化學(xué)鍵。羧基脫水縮合生成的化學(xué)鍵。肽肽 peptide：AA通過肽鍵相連形成的化合物通過肽鍵相連形成的化合物(二肽、三肽、寡肽和多肽二肽、三肽、寡肽和多肽)。寡肽寡肽 oligopeptide ： 一般一般10肽以下肽以下多肽多肽 polypeptide： 一般一般10肽以上肽以上多肽鏈：多肽鏈：由許多氨基酸借肽鍵相互連接而成的一種結(jié)構(gòu)。由許

9、多氨基酸借肽鍵相互連接而成的一種結(jié)構(gòu)。氨基酸殘基：氨基酸殘基：多肽鏈中的氨基酸，由于參與肽鍵的形成，已非原來完整多肽鏈中的氨基酸，由于參與肽鍵的形成，已非原來完整的分子，稱為的分子，稱為。 多肽鏈有兩端：多肽鏈有兩端： N末端、末端、C末端末端天然存在的活性肽天然存在的活性肽 類別：激素、抗菌素、輔助因子類別：激素、抗菌素、輔助因子 實(shí)例：谷胱甘肽實(shí)例：谷胱甘肽( (glutathione)glutathione) 短桿菌肽短桿菌肽促甲狀腺素釋放因子（促甲狀腺素釋放因子（TRH） - -天冬氨酰天冬氨酰- -苯丙氨酸甲酯（甜味劑）苯丙氨酸甲酯（甜味劑）谷胱甘肽谷胱甘肽 谷胱甘肽在體內(nèi)參與氧化還

10、原過程，作為某些氧化還谷胱甘肽在體內(nèi)參與氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔因子，或保護(hù)巰基酶，或防止過氧化物積累。原酶的輔因子，或保護(hù)巰基酶，或防止過氧化物積累。短桿菌肽短桿菌肽S促甲狀腺素釋放因子促甲狀腺素釋放因子 （TRH）蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 高級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) （空間構(gòu)象）（空間構(gòu)象） 由一條肽鏈形成的蛋白質(zhì)只有一、二、三級結(jié)構(gòu)，由一條肽鏈形成的蛋白質(zhì)只有一、二、三級結(jié)構(gòu)， 由二條或二條以上多肽鏈形成的蛋白質(zhì)才可能有由二條或二條以上多肽鏈形

11、成的蛋白質(zhì)才可能有四級結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)。二、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)1、一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(primary structure)：指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的組成及排列順序。酸的組成及排列順序。2、一級結(jié)構(gòu)維系鍵：、一級結(jié)構(gòu)維系鍵：肽鍵肽鍵和和二硫鍵二硫鍵。3、重要性：是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。、重要性：是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。三、蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象三、蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象(conformation) 蛋白質(zhì)的構(gòu)象蛋白質(zhì)的構(gòu)象指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間上的指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。排列、

12、分布及肽鏈的走向。 蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象可分為二、三、四級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象可分為二、三、四級結(jié)構(gòu)。 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵：維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵：次級鍵次級鍵（副鍵），由蛋白質(zhì)分子的主鏈和側(cè)鏈上的極性、非極（副鍵），由蛋白質(zhì)分子的主鏈和側(cè)鏈上的極性、非極性和離子基團(tuán)等相互作用而形成的。性和離子基團(tuán)等相互作用而形成的。 如：氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵、配位鍵。如：氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵、配位鍵。氫鍵氫鍵(Hydrogen Bond)：一個(gè)已和負(fù)電性較強(qiáng)的原子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)已和負(fù)電性較強(qiáng)的原子共價(jià)結(jié)合的氫原子與一個(gè)負(fù)電性較強(qiáng)的原子之間產(chǎn)生的靜電引力。氫原子與一個(gè)負(fù)電

13、性較強(qiáng)的原子之間產(chǎn)生的靜電引力。（一）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（一）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)1. 概念：概念：蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。鏈的構(gòu)象。主鏈與側(cè)鏈主鏈與側(cè)鏈 由肽鍵和由肽鍵和-碳原子構(gòu)成的多肽鏈骨架稱為主鏈，伸展在碳原子構(gòu)成的多肽鏈骨架稱為主鏈，伸展在外的外的R R基團(tuán)稱為側(cè)鏈。基團(tuán)稱為側(cè)鏈。2. 主要形式：主要形式： -螺旋螺旋,-折疊，折疊，-轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲。轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲。主

14、要維系鍵：氫鍵主要維系鍵：氫鍵-螺旋螺旋(-helix)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：右手螺旋：右手螺旋：3.6 AA/圈，螺距圈，螺距0.54nm 。氫鍵維系（形成于每個(gè)肽鍵的氫鍵維系（形成于每個(gè)肽鍵的N-H和第四個(gè)肽鍵的羰基氧之間）。和第四個(gè)肽鍵的羰基氧之間）。側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。側(cè)鏈基團(tuán)影響螺旋的形成和穩(wěn)定。側(cè)鏈基團(tuán)影響螺旋的形成和穩(wěn)定。 (帶同種電荷，側(cè)鏈大的帶同種電荷，側(cè)鏈大的R基或基或Pro存在均妨礙存在均妨礙-螺旋形成螺旋形成)-折疊折疊 轉(zhuǎn)角（轉(zhuǎn)角（-turn-turn）特征特征：多肽鏈中氨基酸殘基多肽鏈中氨基酸殘基n n的羰基上的氧與殘基（的羰基上的氧與殘基（n+3n+

15、3）的氮原上的氫之間形成氫鍵，的氮原上的氫之間形成氫鍵，肽鍵回折肽鍵回折1801800 0 。 無規(guī)無規(guī)則卷則卷曲示曲示意圖意圖無規(guī)無規(guī)則卷則卷曲曲細(xì)胞細(xì)胞色素色素C的的三級三級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)模體模體(motif)/超二級結(jié)構(gòu)：超二級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子中蛋白質(zhì)分子中-螺旋、螺旋、-折疊、折疊、-轉(zhuǎn)角等組轉(zhuǎn)角等組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合體，作為三級結(jié)構(gòu)合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合體，作為三級結(jié)構(gòu)的單元，其基本結(jié)合形式有的單元，其基本結(jié)合形式有:,。結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(structural domain)：分子量大的蛋白質(zhì)分子量大的蛋白質(zhì),多肽鏈往往以超二級結(jié)構(gòu)為單元

16、組成兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽鏈往往以超二級結(jié)構(gòu)為單元組成兩個(gè)或兩個(gè)以上相對獨(dú)立的區(qū)域，再形成三級結(jié)構(gòu)，這些相對獨(dú)立的相對獨(dú)立的區(qū)域，再形成三級結(jié)構(gòu)，這些相對獨(dú)立的區(qū)域稱為結(jié)構(gòu)域。區(qū)域稱為結(jié)構(gòu)域。（二）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)1. 概念概念:整條肽鏈中所有原子或基團(tuán)的空間排布稱為蛋白質(zhì)的三整條肽鏈中所有原子或基團(tuán)的空間排布稱為蛋白質(zhì)的三 級結(jié)構(gòu)，即多肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。級結(jié)構(gòu)，即多肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。2. 維系鍵維系鍵:疏水作用、離子鍵、氫鍵、疏水作用、離子鍵、氫鍵、Vander Waals力等次級鍵。力等次級鍵。三

17、級結(jié)構(gòu)的特征：三級結(jié)構(gòu)的特征： 含多種二級結(jié)構(gòu)單元；含多種二級結(jié)構(gòu)單元； 有明顯的折疊層次；有明顯的折疊層次； 是緊密的球狀或橢球狀實(shí)體；是緊密的球狀或橢球狀實(shí)體； 分子表面有一空穴分子表面有一空穴( (活性部位活性部位) )； 疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部， 親水側(cè)鏈暴露在分子表面。親水側(cè)鏈暴露在分子表面。3. 三級結(jié)構(gòu)的重要性：三級結(jié)構(gòu)的重要性：三級結(jié)構(gòu)形成后，蛋白質(zhì)分子才形成固有的分子形狀；三級結(jié)構(gòu)形成后，蛋白質(zhì)分子才形成固有的分子形狀；才具有親水膠體的特性；才具有親水膠體的特性；功能蛋白質(zhì)的活性部位得以形成并表現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)活性。功能蛋白質(zhì)的活性部位得以形成并表現(xiàn)出

18、相應(yīng)的生物學(xué)活性。核糖核酸酶三級結(jié)構(gòu)示意圖核糖核酸酶三級結(jié)構(gòu)示意圖N His12CHis119Lys41 (三）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)三）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(quarternary structure)1. 概念概念:蛋白質(zhì)分子中各個(gè)亞基的空間排布及亞基接觸部位的布蛋白質(zhì)分子中各個(gè)亞基的空間排布及亞基接觸部位的布 局和相互作用局和相互作用,稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)分子中每條具獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為蛋白質(zhì)分子中每條具獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為亞基亞基(subunit).2. 維系鍵維系鍵:疏水鍵疏水鍵、氫鍵、離子鍵等次級鍵。、氫鍵、離子鍵等次級鍵。Hemoglobin思考：思考

19、：四級結(jié)構(gòu)中的亞基與結(jié)構(gòu)域有何不同？四級結(jié)構(gòu)中的亞基與結(jié)構(gòu)域有何不同？一、根據(jù)分子形狀分類：一、根據(jù)分子形狀分類： 球狀蛋白：長短軸之比球狀蛋白：長短軸之比10二、根據(jù)組成分類：二、根據(jù)組成分類： 單純蛋白單純蛋白 結(jié)合蛋白：單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白：單純蛋白質(zhì)+輔基或非蛋白質(zhì)部分輔基或非蛋白質(zhì)部分三、根據(jù)生物學(xué)功能分類三、根據(jù)生物學(xué)功能分類四、根據(jù)溶解度分類：四、根據(jù)溶解度分類： 可溶性蛋白；醇溶性蛋白；不溶性蛋白可溶性蛋白；醇溶性蛋白；不溶性蛋白蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一級

20、結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) 空間構(gòu)象空間構(gòu)象 功能功能1.一級結(jié)構(gòu)中一級結(jié)構(gòu)中“關(guān)鍵關(guān)鍵”部分相同部分相同,其功能相同。其功能相同。 如：不同動(dòng)物來源的胰島素如：不同動(dòng)物來源的胰島素 一級結(jié)構(gòu)中一級結(jié)構(gòu)中“關(guān)鍵關(guān)鍵”部分變化部分變化,其活性也改變。其活性也改變。Insulin of human2. 一級結(jié)構(gòu)不同，生物學(xué)功能各異。一級結(jié)構(gòu)不同，生物學(xué)功能各異。 如：催產(chǎn)素與抗利尿激素如：催產(chǎn)素與抗利尿激素 S S加壓素加壓素 H2N 半胱半胱 酪酪 苯丙苯丙 谷胺谷胺 天胺天胺 半胱半胱 脯脯 精精 甘甘 催產(chǎn)素催產(chǎn)素 H2N 異亮異亮 亮亮 3 83. 一級結(jié)構(gòu)變化與疾病的產(chǎn)生一級結(jié)構(gòu)變化與疾病的產(chǎn)生-分子

21、病分子病 如：如：鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血 Hb： 6位位Glu Val二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)前體的活化蛋白質(zhì)前體的活化 另外，蛋白質(zhì)僅構(gòu)象發(fā)生改變另外，蛋白質(zhì)僅構(gòu)象發(fā)生改變,其功能活性也隨之改變。其功能活性也隨之改變。 核糖核酸酶核糖核酸酶2. 蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象(allosteric effect):指一個(gè)蛋白質(zhì)與其配體指一個(gè)蛋白質(zhì)與其配體(或其它蛋白或其它蛋白)結(jié)合后結(jié)合后,引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變發(fā)生改變,并伴隨其活性發(fā)生改變。并伴隨其活性發(fā)生改變。協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng):一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后一個(gè)亞基與

22、其配體結(jié)合后,能影響此寡聚體中能影響此寡聚體中 另一亞基與配體的結(jié)合。另一亞基與配體的結(jié)合。 如如: Hemoglobin與與Myoglobin第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、兩性解離和等電點(diǎn)一、兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)兩末端的氨基和羧基及側(cè)鏈中某些基團(tuán)在一定條件下蛋白質(zhì)兩末端的氨基和羧基及側(cè)鏈中某些基團(tuán)在一定條件下均可解離均可解離.1. 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( pI):使某一蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷數(shù)使某一蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷數(shù)相等相等,凈電荷為零時(shí)溶液的凈電荷為零時(shí)溶液的PH值。值。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀、離子交換和電泳等基本原理均以蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀、離子交換和電泳

23、等基本原理均以蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)的特性為基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)的特性為基礎(chǔ)。 電泳電泳:帶電粒子在電場中向電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，帶電粒子在電場中向電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，可用于分離、鑒定蛋白質(zhì)?？捎糜诜蛛x、鑒定蛋白質(zhì)。二、高分子性質(zhì)，即膠體性質(zhì)二、高分子性質(zhì)，即膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)為分子量蛋白質(zhì)為分子量1萬至萬至100萬的高分子物質(zhì)萬的高分子物質(zhì),其在溶液中形成的質(zhì)其在溶液中形成的質(zhì)點(diǎn)直徑在點(diǎn)直徑在1-100nm膠體質(zhì)點(diǎn)范圍內(nèi)。膠體質(zhì)點(diǎn)范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素:蛋白質(zhì)顆粒表面具水化層蛋白質(zhì)顆粒表面具水化層 蛋白質(zhì)顆粒表面帶同性電荷蛋白質(zhì)顆粒表面帶同性電荷去

24、除這兩個(gè)穩(wěn)定因素去除這兩個(gè)穩(wěn)定因素,蛋白質(zhì)極易沉淀。蛋白質(zhì)極易沉淀。蛋白質(zhì)具有分子擴(kuò)散現(xiàn)象；布朗運(yùn)動(dòng)；可用超速離心法分離蛋蛋白質(zhì)具有分子擴(kuò)散現(xiàn)象；布朗運(yùn)動(dòng)；可用超速離心法分離蛋白質(zhì)；有較大的粘度，隨蛋白質(zhì)分子的水合作用和分子的不對白質(zhì)；有較大的粘度，隨蛋白質(zhì)分子的水合作用和分子的不對稱性增大而增大；不能透過半透膜，可用透析法純化蛋白。稱性增大而增大；不能透過半透膜，可用透析法純化蛋白。三三.蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀1.概念：蛋白質(zhì)分子聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)概念：蛋白質(zhì)分子聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀。的沉淀。2.常用的沉淀方法常用的沉淀方法（1）鹽析法：）鹽析法：(NH

25、4)2SO4、NaCl、Na2SO4低鹽濃度可使蛋白質(zhì)溶解度增加，稱為鹽溶作用。低鹽濃度可使蛋白質(zhì)溶解度增加，稱為鹽溶作用。高鹽濃度因破壞蛋白質(zhì)的水化層并中和其電荷，促使蛋白質(zhì)高鹽濃度因破壞蛋白質(zhì)的水化層并中和其電荷，促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，稱為鹽析作用。顆粒相互聚集而沉淀，稱為鹽析作用。采用不同鹽濃度可將蛋白質(zhì)分別沉淀，稱分級沉淀；并不易采用不同鹽濃度可將蛋白質(zhì)分別沉淀，稱分級沉淀；并不易發(fā)生變性。發(fā)生變性。（2）有機(jī)溶劑沉淀：乙醇）有機(jī)溶劑沉淀：乙醇、甲醇、丙酮等甲醇、丙酮等（3）某些酸類沉淀：）某些酸類沉淀： PHPI時(shí)，時(shí)，Pb2+， Hg2+， Ag+， Cu2+（5）加熱凝固

26、：變性沉淀，偏酸或偏堿不易。）加熱凝固：變性沉淀，偏酸或偏堿不易。蛋白質(zhì)的凝固作用：蛋白質(zhì)經(jīng)加熱變成較堅(jiān)固的凝塊，不易蛋白質(zhì)的凝固作用：蛋白質(zhì)經(jīng)加熱變成較堅(jiān)固的凝塊，不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中，稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中，稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。四四.蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)1.概念：概念：在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，從而導(dǎo)致其生物學(xué)活性的喪失和一些理化發(fā)生改變或破壞，從而導(dǎo)致其生物學(xué)活性的喪失和一些理化性質(zhì)的改變的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的變性。性質(zhì)的改變的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的變性。2.變性

27、因素：變性因素： 理：加熱、高壓、紫外線、超聲波、劇烈震蕩等理：加熱、高壓、紫外線、超聲波、劇烈震蕩等 化：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子、尿素、乙醇、丙酮等化：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子、尿素、乙醇、丙酮等3.變性的本質(zhì)：變性的本質(zhì)：蛋白質(zhì)分子空間蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的改變或破壞（二硫鍵和非構(gòu)象的改變或破壞（二硫鍵和非共價(jià)鍵破壞），不涉及一級結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵破壞），不涉及一級結(jié)構(gòu)改變或肽鍵的斷裂。改變或肽鍵的斷裂。4.變性作用的特征：生物活性喪失；某些理化性質(zhì)改變（溶變性作用的特征：生物活性喪失；某些理化性質(zhì)改變（溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶能力消失，易被蛋白酶水解。）解度降低，粘度增加，結(jié)晶能力消失，易被蛋白酶

28、水解。）5.變性作用的應(yīng)用舉例：變性作用的應(yīng)用舉例：變性因素應(yīng)用于消毒及滅菌，制備、保存蛋白質(zhì)制劑需防止變性。變性因素應(yīng)用于消毒及滅菌，制備、保存蛋白質(zhì)制劑需防止變性。6.復(fù)性：去除變性因素后，有些變性程度較輕的蛋白質(zhì)仍可復(fù)性：去除變性因素后，有些變性程度較輕的蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能。恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能。許多蛋白質(zhì)的變性為不可逆變性。許多蛋白質(zhì)的變性為不可逆變性。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)不一定發(fā)生變性。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)不一定發(fā)生變性。五五.蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)（可做定性或定量測定）蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)（可做定性或定量測定）1.茚三酮反應(yīng)茚三

29、酮反應(yīng)2.雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 氨基酸無此反應(yīng)氨基酸無此反應(yīng)3.酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng)六六. 蛋白質(zhì)的紫外吸收蛋白質(zhì)的紫外吸收 A280nm第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理根據(jù)溶解度不同的分離純化方法根據(jù)溶解度不同的分離純化方法 鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀根據(jù)分子大小不同的分離純化方法根據(jù)分子大小不同的分離純化方法 透析、超濾、凝膠層析、離心透析、超濾、凝膠層析、離心根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法 電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析根據(jù)配體不同的分離純化方法根據(jù)配體不同的分離純化方法 親和層析

30、親和層析透析及超濾法透析及超濾法* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。物分開的方法。* * 超濾法超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。溶液的目的。丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀時(shí)，必須在時(shí)，必須在04低溫下進(jìn)行，低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以質(zhì)被丙酮

31、沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。沉淀。 * * 免疫沉淀法：免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分復(fù)合物的性質(zhì)，可

32、從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。離獲得抗原蛋白。 電泳電泳(elctrophoresis) 蛋白質(zhì)在高于或低于其蛋白質(zhì)在高于或低于其pIpI的溶液中為帶電的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)質(zhì)的技術(shù), , 稱為稱為電泳電泳。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。膠電泳等。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:*聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)*SDS-PAGE，常用于蛋白質(zhì)分子量的

33、測定。，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳等電聚焦電泳(IEF)，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。層析層析(chromatography) 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法蛋白質(zhì)分離常用的層析方法: :* * 離子交換層析：離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。質(zhì)不同進(jìn)行分離。* * 凝膠過濾凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，又稱分子篩層析，利利用用各各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。蛋白質(zhì)分子大小不同分離。超速離心超速離心* * 超速離心法超速離心法(ult