微生物鑒定之生化實驗大全

1、（一）碳水化合物代謝實驗糖（醇、苷）類發(fā)酵實驗（1) 原理：細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關(guān)，故分解糖的能力各不相同，細菌分解糖類后的終產(chǎn)物亦不一致，在含糖培養(yǎng)基中加入指示劑，若細菌分解糖則產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)基顏色改變，從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物。（2) 基本培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5%-1%的糖類（單糖、雙糖、或者多糖）、醇類（甘露醇、肌醇）苷類（水楊苷、菊糖等).培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。（3) 實驗方法：取某一種細菌的24h純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養(yǎng)基內(nèi)，37培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并記錄。（4

2、) 結(jié)果判定：如果接種進去的細菌可以發(fā)酵某種糖或醇，則可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紫色變成黃色，如果不發(fā)酵，則仍保持紫色。如發(fā)酵的同時又產(chǎn)生氣體，則在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。（5) 應用：是鑒定細菌最主要最基本的實驗，特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。氧化型與發(fā)酵型（O/F)的測定（1） 原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必需有氧的參加，稱為氧化型（O），細菌在分解葡萄糖過程中可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型(F)。發(fā)酵型細菌無論在有氧無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型(-)。這在區(qū)別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。（2） 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀

3、0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1%溴麝香草酚藍3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正PH至7.2，然后加葡萄糖和指示劑，加熱溶解，分裝試管，3-4mL/管；115，高壓蒸汽滅菌20min，取出冷卻成瓊脂柱。（3） 試驗方法：挑取18-24h的幼齡斜面培養(yǎng)物，穿刺接種，每種細菌接種兩管，于其中一管覆蓋1mL液體石蠟，37培養(yǎng)24h或更長時間。（4） 結(jié)果判定：封油管未封油管發(fā)酵型（F）產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)酸（黃色）氧化型（O）不產(chǎn)酸（綠色）產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)堿型（-）不產(chǎn)酸（綠色）不產(chǎn)酸（綠色）（5）應用：O/F試驗主要適用于G-腸道桿菌的鑒別。腸桿菌科的細菌為發(fā)酵型，

4、其他腸道菌為非發(fā)酵型，非發(fā)酵型細菌為氧化型或產(chǎn)堿型。該試驗也用于鑒別葡萄球菌（F）和微球菌（O）。-半乳糖苷（ONPG)實驗（1） 原理：有的細菌可以產(chǎn)生-半乳糖苷酶，能分解鄰-硝基酚-D-半乳糖苷,而生成黃色的鄰-硝基酚，在很低的濃度下也可以檢測出。（2） 培養(yǎng)基：鄰硝基酚-半乳糖苷0.6g，0.01moL/L PH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過濾除菌，在無菌條件下與1%蛋白胨水混合，分裝試管，每管2-3mL。無菌檢驗后備用。（3） 實驗方法：取一環(huán)細菌純培養(yǎng)物接種在ONPG培養(yǎng)基上置37培養(yǎng)1-3h或24h如有-半乳糖苷酶，會在3h內(nèi)產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚；如無

5、此酶，則在24h內(nèi)不變色。（4） 應用：該試驗常用于遲緩發(fā)酵乳糖的細菌的快速鑒定。如埃希菌屬枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬等為陽性；不發(fā)酵乳糖的沙門菌屬、變形桿菌屬等為陰性。ONPG試驗不能代替乳糖發(fā)酵試驗，只能測定-半乳糖苷酶的活性。七葉苷水解實驗（1） 原理：有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的Fe2+反應，生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基呈黑色。（2） 應用：主要用于腸球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性，也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。甲基紅實驗（MR）（1） 原理：細菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸，當產(chǎn)酸量大，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下時，加入甲基紅指

6、示劑而變紅，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、酮、醛、氣體和水等）則培養(yǎng)基的pH仍在PH5.4以上，故加入甲基紅試劑呈橘黃色，為陰性。（2） 實驗方法：一種細菌的24h培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中置37培養(yǎng)48-72h，取出后加甲基紅試劑3-5滴，凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽性，橙色為可疑，黃色者為陰性。（3） 應用：主要用于鑒別大腸埃希菌（+）與產(chǎn)氣腸桿菌（-），前者為陽性后者為陰性。沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬陽性，腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬陰性。V-P實驗（1） 原理：有些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，

7、乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應生成紅色化合物。若培養(yǎng)基中的胍基含量過少，則可加入少量含胍基的化合物等。（2） V-P試劑：肌酸0.3%或原粉。40%的NaOH溶液。（3） 實驗方法：接種實驗菌于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（與甲基紅實驗相同）中，每次兩個重復，置適溫培養(yǎng)2-6d，取培養(yǎng)液和40%NaOH等量想混，加入少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為實驗陽性反應，有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色反應。（4） 應用：本實驗常與甲基紅實驗一起用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實驗明膠液化實驗（1） 原

8、理：某些可以產(chǎn)生一種胞外蛋白水解酶（明膠酶），能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。（2） 實驗方法：取18-24h的斜面培養(yǎng)物穿刺接種，并有兩支未接種的空白對照。（3） 結(jié)果觀察：與30培養(yǎng)20天后觀察，明膠液化的為陽性。由于室溫下明膠培養(yǎng)基呈液狀，因此在觀察結(jié)果時，應將其放置于4的冰箱中30min后拿出觀察。若明膠仍能全部凝固為陰性，有部分或全部不能凝固為陽性。吲哚實驗（Ind）（1） 原理：某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當加入吲哚試劑（對二甲氨基笨甲醛）后形成紅色的玫瑰吲哚。該試驗也稱靛基質(zhì)試驗。（2） 培養(yǎng)基：

9、蛋白胨水培養(yǎng)基。（3） 實驗方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35孵育24-48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀察結(jié)果。（4） 結(jié)果：于兩夜面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。（5） 應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌的鑒別。大腸埃希菌為陽性，沙門菌屬則為陰性。H2S實驗（1） 原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產(chǎn)酸硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結(jié)合形成黑色沉淀物（硫化鐵或硫化鉛沉淀）。（2） 實驗方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，于35孵育24-48h，觀察有無黑色沉淀出現(xiàn)。（3） 結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不

10、變?yōu)殛幮?。?） 應用：主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其他菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。尿素分解試驗（1） 原理：某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。（2） 培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。（3） 實驗方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35孵育18-24h觀察結(jié)果。（4） 結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴＃?） 應用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌的普通變形桿菌脲酶陽性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和

11、產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。苯丙氨酸脫氫酶實驗（1） 原理：測定細菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氫酶。細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氫酶使苯丙氨酸脫氫后生成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應。（2） 培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。（3） 實驗方法：將待檢菌大量接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基中，于35孵育18-24h，滴加10%三氯化鐵試劑3-4滴，自斜面上方流下。（4） 結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。應立即觀察結(jié)果，延長反應時間會引起退色。（5） 應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其他細菌均為陰性。氨基酸脫羧試驗（1） 原理：某些細菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺

12、和CO2。由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。（2） 培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。（3） 試驗方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸（賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸）脫羧酶試驗管一支氨基酸脫羧酶對照管（無氨基酸），各覆蓋液體石蠟油，35孵育1-4d每日觀察結(jié)果。（4） 結(jié)果：對照管應為黃色，若為溴甲酚紫指示劑，則測定管呈紫色為陽性，若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現(xiàn)紫色則實驗無意義，不能做出判斷。（5） 應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。（三）碳源利用

13、實驗枸櫞酸鹽利用試驗（CIT）（1） 原理：某些細菌能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鈉為唯一碳源而獲得能量，能利用枸櫞酸鹽的細菌也能利用銨鹽作為氮源，分解后生成碳酸鈉和氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，導致溴麝香草酚藍pH指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色。（2） 培養(yǎng)基：含有枸櫞酸鹽的銨鹽的西蒙氏和柯氏培養(yǎng)基。（3） 實驗方法：將待檢菌接種于含有枸櫞酸鹽的銨鹽的西蒙氏和柯氏培養(yǎng)基。（4） 結(jié)果：培養(yǎng)后變藍為陽性，培養(yǎng)7天仍無細菌生長，培養(yǎng)基不變色者為陰性。（5） 應用：該試驗用于腸桿菌科中各菌屬間的鑒別。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬均為陰性。（4） 各種酶類實驗氧化酶試驗（OX試驗）（1） 原理：氧化酶（即細胞色素氧化酶

14、），是細胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，生成醌類化合物。因此，本實驗結(jié)果與細胞色素C的存在有關(guān)。（2） 實驗方法：直接法：四甲基對苯二胺鹽酸鹽（紫色為陽性）或二甲基對苯二胺二鹽酸鹽（紅色為陽性），二者分別配成1%的溶液，取2-3滴直接滴加試劑于被撿菌落上，或用濾紙沾取待檢菌落，滴加試劑觀察結(jié)果；濾紙法：將濾紙浸泡在試劑中制成試劑紙片，取足夠菌落涂于其上觀察結(jié)果。（3） 結(jié)果：有細胞色素氧化酶的菌落，10S內(nèi)呈深紫色為陽性。10-60S內(nèi)出現(xiàn)紫色者則不屬于腸桿菌科，要進一步鑒定。為保證結(jié)果的準確性，可分別以銅綠假單胞菌

15、和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。（4） 應用：如奈瑟菌屬、假單胞菌屬、莫拉菌屬呈陽性，腸桿菌科呈陰性。本試驗不宜用生銹的接種環(huán)，避免火焰滅菌時表面形成氧化物而引起假陽性反應。過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）（1） 原理：具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。（2） 實驗方法：取潔凈玻片（或濾紙），用接種環(huán)挑取細菌，加入3%過氧化氫數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。（3） 結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。（4） 應用：G+球菌中，葡萄球菌的微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故該試驗常用于G+球菌的初步分群。本實驗不宜用在血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落（易出現(xiàn)假陽性

16、），每次試驗應設(shè)立對照，陽性反應對照菌為金黃色葡萄球菌，陰性對照菌為鏈球菌。亞硝酸鹽還原實驗（1） 原理：硝酸鹽還原反應包括兩個過程：一是合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)的終末受氫體。硝酸鹽還原過程可因細菌不同而異。待檢菌培養(yǎng)基中是否含亞硝酸基，可加入-萘胺和對氨基苯磺酸，若最后形成N-萘胺偶氮苯磺酸，此為紅色重氮化合物染料，說明該菌具有還原硝酸鹽的能力。（2） 方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基（內(nèi)含小倒管）中，35孵育1-4d。將甲、乙等量混合液（用時混合）（約0.1ml）加于試管內(nèi)

17、，立即觀察結(jié)果。（3） 結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性反應。若加入試劑后無顏色反應，可能是：硝酸鹽沒被還原，試驗陰性；硝酸鹽還原為氨和氮等其他物質(zhì)而導致假陰性結(jié)果，這時應在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗確實為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表面試驗為假陰性。（4） 應用：腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌屬均可產(chǎn)生氮氣；有些厭氧菌如韋榮菌等試驗也為陽性。陽性對照為大腸埃希菌，陰性對照為醋酸鈣不動桿菌無硝變種。其他生化試驗凝固酶試驗（1） 原理：致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細胞壁結(jié)合的凝固酶，稱結(jié)合凝固酶或凝聚因子，其作用是在該菌的表面有纖維蛋白原的特異受體，當細菌混懸于人或兔血漿時纖維蛋白原與菌受體兩者交聯(lián)而使細菌凝聚，玻片法陽性就是這種凝聚因子所致；另一種分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，作用類似凝血酶原物質(zhì)，可被人或兔血漿中的協(xié)同因子激活變?yōu)槟笜拥奈镔|(zhì)后，使液態(tài)的纖維蛋白變?yōu)楣虘B(tài)的纖維蛋白，從而使血漿凝固。試管法