毒理學研究方法

1、(課件重點)毒理學研究方法1. 體內(nèi)試驗(in vivo) ：也稱整體動物試驗，可嚴格控制接觸條件，測定多種類型的毒作用。大鼠，小鼠，豚鼠，家兔，狗和猴等。也有魚類，鳥類，昆蟲等2體外試驗(in vitro): 利用游離器官、培養(yǎng)的細胞或細胞器、生物模擬系統(tǒng)進行毒理學研究。器官(肝、胚胎)，細胞，細胞器，分子等3人體觀察(human toxicology)，事故或志愿者4流行病學研究(epidemiological study) ：為什么有選擇毒性1 物種和細胞學的差異( 植物生長調(diào)節(jié)劑) 2 蓄積能力3. 代謝過程和速率4. 損傷的修復能力非損害作用(non-adverse effect)所

2、致機體發(fā)生的一切生物學變化都是暫時的、可逆的，應在機體代償能力范圍之內(nèi)，不造成機體形態(tài)、生長發(fā)育過程及壽命的改變、不降低機體維持穩(wěn)態(tài)的能力和對額外應激代償?shù)哪芰?、不影響機體的功能容量，如進食量、體力勞動負荷能力等涉及到解剖、生理生化和行為方面的指標，也不引起機體對其他環(huán)境有害因素的易感性增高。損害作用(adverse effect)所致的機體生物學改變是持久的、不可逆的，造成機體功能容量的各項指標改變、維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)能力下降、對額外應激狀態(tài)的代償能力降低以及對其他環(huán)境有害因素的易感性增高，使機體正常形態(tài)、生長發(fā)育過程均受到影響，壽命縮短生物膜 biomembrane定義：將細胞或細胞器與周圍環(huán)

3、境分隔開的一層半透膜。功能： 將細胞或細胞器與周圍環(huán)境隔離；保持細胞或細胞器內(nèi)部理化性質(zhì)的穩(wěn)定；選擇地允許或部允許某些物質(zhì)通過，主動攝入或排出一些物質(zhì)生物轉(zhuǎn)運過程的機理1、被動轉(zhuǎn)運1)簡單擴散：溶液中的化學物質(zhì)分子，由濃集部位向各個方向分散，直到全部分子均勻分布在溶液中。simple diffusion:化學物質(zhì)由濃度較高部位透過生物膜向濃度較低部位分散的過程。特點：化學物不與膜起反應；不消耗代謝能量；膜兩側(cè)濃度差愈大，脂溶性愈高，其簡單擴散速度快；在毒理學上，是大多數(shù)化學物透過生物膜的主要轉(zhuǎn)運方式。簡單擴散的條件：膜兩側(cè)存在濃度差；外來化合物有脂溶性；是非解離狀態(tài)2)濾過filtration

4、:膜孔濾過指化學物通過細胞膜上的親水性孔道透過細胞膜的過程。親水性孔道：由嵌入脂質(zhì)雙分子層中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)親水性氨基酸組成，不同的細胞膜，其孔徑大小不一，小腸上皮細胞4Ao ， 腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞為40 Ao。動力： 滲透壓梯度和液體靜壓。在它們的作用下，大量水及分子直徑小于孔道的化學物可經(jīng)膜孔道，透過生物膜，完成其生物轉(zhuǎn)運過程。2、特殊轉(zhuǎn)運1)主動轉(zhuǎn)運：不溶于脂質(zhì)的親水性化合物由低濃度處透過生物膜向高濃度處移動并引起消耗能量的過程。特點：逆濃度梯度轉(zhuǎn)運；通過載體；需消耗能量；具有一定的選擇性，存在競爭性抑制，可飽和；2)易化擴散(facilitated diffusion): 指某些不易溶

5、于脂質(zhì)的親水性化合物，透過生物膜由高濃度處向低濃度處轉(zhuǎn)移的過程。其機理：化合物與膜上的蛋白質(zhì)或酶構(gòu)成的載體結(jié)合(與主動轉(zhuǎn)運相同)，只能由高向低轉(zhuǎn)移，它不需消耗代謝能量。3)膜動轉(zhuǎn)運：指細胞與外界環(huán)境之間進行的某些顆粒物或大分子物質(zhì)交換過程。此過程需要耗能。吞噬( phagocytosis) 胞飲 (pinocytosis) 胞吐( exocytosis )氣溶膠(aerosol) 指固體或/ 和液體微粒穩(wěn)定地懸浮于氣體介質(zhì)中形成的分散體系，其中的氣體介質(zhì)稱為連續(xù)相，微粒稱為分散相，其成分復雜，大小不一。分布的原因1）體內(nèi)各種屏障：血腦屏障，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毛細血管壁構(gòu)成，為緊密融合在一起的扁平

6、內(nèi)皮細胞，管外包裹的星形膠質(zhì)細胞。 胎盤屏障2）與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合a血漿中各種蛋白質(zhì)均有結(jié)合其他化學物的功能，特別是白蛋白的結(jié)合量最高。b不同的化合物與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合的量不同，結(jié)合型的化合物由于分子量大，不能跨膜轉(zhuǎn)運，暫無生物效應，不能被代謝排泄，可延緩消除過程和延長化合物的毒作用。作用：兩重意義，即急性中毒的保護作用，使血液濃度降低；離開接觸后，由于血液濃度下 降，貯存庫中的毒物重新就會釋放進入血液，具有潛在的危害。主要與清蛋白濃度、結(jié)合親和力、與內(nèi)源性物質(zhì)的競爭結(jié)合的差異3）與組織成分的結(jié)合指組織中的一些特殊結(jié)合蛋白，包括各種蛋白質(zhì)、粘多糖、核蛋白及磷脂。特殊的親和力，CO與血紅蛋白；百草枯

7、與肺肝、腎組織：金屬硫蛋白4）脂肪和骨骼中的貯存脂溶性的有機物易于分布和蓄積在脂肪組織內(nèi)；鉛、氟易于貯存在骨骼中；雙重性，降低血中毒物的濃度；重新釋放，將造成潛在的危害共氧化：指氫過氧化物的還原和其他底物氧化生成脂質(zhì)氫過氧化物的過程葡糖醛酸結(jié)合是II相反應中最普遍進行的一種，由UDP葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶催化。谷胱甘肽結(jié)合，是由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶催化的 GSH吉合反應。它在親電子化合物解毒及自由基解 毒中起著重要作用 生物轉(zhuǎn)化的復雜性 1）多樣性：a一種外來化合物在體內(nèi)可能有多種不同的代謝轉(zhuǎn)化途徑，生成各種不同的代謝產(chǎn)物。b同一化合物經(jīng)不同的代謝，產(chǎn)生的毒性作用可能不同c化合物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化類型

8、取決于化合物的性質(zhì)、劑量、環(huán)境及機體的因素，即影響毒 性作用的因素。2）連續(xù)性：外來化合物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化常常是多個反應連續(xù)進行的。3）兩重性：生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果有解毒和增毒兩種。當然，大多數(shù)是解毒。4）代謝飽和：外來化合物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，由酶催化進行的，當其濃度到一定程度，也就 是說代謝過程所需的基質(zhì)可能被耗盡；代謝酶能力有限；造成單位時間內(nèi)代謝產(chǎn)物不再 隨底物增加而增加，有可能發(fā)生代謝途徑的改變，這種代謝途徑被飽和的現(xiàn)象稱代謝飽 和（metablic saturation）。5）代謝酶的誘導與抑制：酶的誘導（induction）指有些外來化合物可使某些代謝酶合成增加 并伴有活力增強的現(xiàn)象。抑制

9、（inhibition）則是表現(xiàn)為活力下降影響毒性的因素 可分為四大類：毒物、機體、接觸條件及外界環(huán)境。毒性效應宿主因素環(huán)境因素基礎(chǔ)毒性分類：根據(jù)接觸毒物的時間長短分為急性毒性、短期重復劑量毒性、亞慢性毒性、慢性毒性。相應所進行的觀察和評價毒效應的試驗即為急性毒性試驗、短期重復劑量毒性試驗、亞慢性毒性試驗、慢性毒性試驗。 急性毒性作用的有關(guān)參數(shù)Q以死亡為終點（上限參數(shù)）絕對致死劑量或濃度（LDI00或LC00）半數(shù)致死劑量或濃度（LD50或LC50）最小致死劑量或濃度（ MLD, LD01或MLC,LGi ）最大非致死劑量或濃度（MNLD, LD0或MNLC,LC）。非致死性指標為檢測終點（下

10、限參數(shù)）急性毒性LOAEL既察到有害作用的最低劑量）急性毒性NOAEL去觀察到有害作用的劑量）為什么進行替代試驗？ ？ ？動物保護；降低試驗成本；縮短試驗周期3R :替代，減少，優(yōu)化蓄積作用的意義1 .是外源化學物產(chǎn)生亞慢性、慢性毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。2 .是評價外源化學物是否可能產(chǎn)生慢性中毒的重要指標。3 .在制訂衛(wèi)生標準時，蓄積毒性的大小是選擇安全系數(shù)的重要考慮因素之一。4 .耐受也是蓄積毒性的表現(xiàn)之一。亞慢性、慢性毒性試驗劑量與設組原則：設3個劑量組和1個陰性（溶劑）對照組。設及劑量時應考慮人類的實際接觸量。高劑量：動物表現(xiàn)出明顯的中毒效應，不發(fā)生或僅有個別死（10% ）。中間劑量：動物出現(xiàn)

11、輕度中毒效應，應相當于最小有作用劑量水平（ LOAEL）. 低劑量：無中毒反應，應相當于最大無作用劑量水平 （NOAEL）。要高于人得實際接觸水平。 對照組：排除混雜因素劑量組間的組距 24倍，最大不超過10倍。 劑量設計參考原則和方法對能求出LD0的化學物：參考同一動物種屬品系和同一染毒途徑的短期毒性資料，最高劑量組為1/10- 1/20LD so,最低劑量至少為人體攝入量的3倍。再設中間劑量。對食品藥品等毒性很低的化學物：藥品以臨床用藥量的10,30,100倍（大鼠）食品以人體攝入量的 100, 200,300倍（大鼠）慢性毒T試驗：參考亞慢性毒性實驗結(jié)果設計。急性毒性作用概念及急性毒性實

12、驗目的；亞慢性毒性作用概念及亞慢性毒性實驗目的；慢性毒性作用概念及慢性毒性實驗目的；蓄積毒性與蓄積系數(shù) ；LD50; NOAEL;LOAE;LADI;臟器系數(shù)；食物利用率 化學致癌物 致癌機制：遺傳毒性致癌物 +非遺傳毒性致癌物（表觀遺傳毒性致癌物） 代謝角度：直接致癌物 +間接致癌物（前致癌物，近致癌物，終致癌物） 致癌階段：引發(fā)劑+促長劑+助致癌物+完全致癌物化學致癌的三階段學說；化學致癌的機制；化學致癌物的分類；判斷化學致癌物的試驗方法2、選擇致突變試驗的成套觀察項目（ test battery ）配套原則：1.多種遺傳學終點兼顧。2.多種物種兼顧。3.體內(nèi)和體外實驗配合。4.體細胞與生

13、殖細胞兼顧 。 致突變試驗與致癌試驗的關(guān)系 致突變試驗是致癌短期篩檢試驗中的一種，可檢出遺傳毒性致癌物。 但也能出現(xiàn)假陽性如遺傳毒性非致癌物和假陰性如非遺傳毒性致癌物。1. 發(fā)育毒性（developmental toxicity ）:指出生前后接觸有害因素，子代個體發(fā)育為成體之前誘發(fā)的任何有害影響。具體表現(xiàn)為(1)發(fā)育生物體死亡：吸收胎、流產(chǎn)、死胎、(2)生長改變：生長遲緩：生長發(fā)育指標低于正常對照均值的2個標準差(3)結(jié)構(gòu)異常：畸形，包括外觀畸形，骨骼畸形，內(nèi)臟畸形。(4)功能缺陷：出生后個體免疫，神經(jīng)行為缺陷，兒童早期腫瘤2 .發(fā)育毒理學(developmental toxicology)

14、 :研究出生前暴露于環(huán)境有害因子導致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的作用機制、發(fā)病機理、影響因素和毒物動力學等。是毒理學的重要分支之一。3 .畸形(malformation ):發(fā)育生物體解剖學上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷。分為嚴重畸形和輕微畸形。嚴重畸形(major malformation )：對外觀、生理功能和(或)壽命有明顯影響輕微畸形(minor malformation ):對外觀、生理功能只有輕微影響或沒有影響。4 .器官形成期(critical peroid) :從胚泡著床到硬腭閉合的時期，是畸形發(fā)生的關(guān)鍵時 期，也成致畸敏感期。5 .致畸物(致畸原teratogen):能引起畸形的環(huán)境因子。6 .

15、致畸作用(teratogenesis )致畸物引起畸形的過程 。7 .致畸性(teratogenicity ):致畸物引起畸形的能力。8 .變異(variation ):同一種屬的親代和子代之間或子代的個體之間，出現(xiàn)不同程度的差異。變異由遺傳和遺傳外因素控制,或由于分化改變而引起。一般變異指小的或次要的結(jié)構(gòu)改變，一般不影響正常生理功能，也不危及生命。值得注意的變異是致畸試驗中，有劑量效應關(guān)系異常增多的變異。9 、 胚體毒性(embryotoxicity ):外源性理化因子對孕體著床前后直到器官形成期結(jié)束時 的有害影響。10、胎體毒性或胎兒毒性(fetoxicity ): 對孕體器官形成期結(jié)束以后的有害影響。11、胚胎毒性(embryo-fetal toxicity) :胚體毒性和胎體毒性的統(tǒng)稱。一般指孕體的死亡 和生長發(fā)育遲緩，不包括結(jié)構(gòu)畸形。胚胎毒性12、出生缺陷(birth defect ):指出生前期即已形成的發(fā)育障礙，主要包括畸形和功能 缺陷。13