細(xì)菌纖維素酶結(jié)構(gòu)和功能總結(jié)要點

1、纖維素酶結(jié)構(gòu)和功能概述了細(xì)菌纖維素酶的水解機制及其基因的克隆和表達，總結(jié)了近年來纖維素酶結(jié)構(gòu)和功能方面的研究成果，展望細(xì)菌纖維素酶領(lǐng)域的研究前景。1 引言2 纖維素分解性細(xì)菌的類群 纖維素分解性細(xì)菌是指能分解纖維素的細(xì)菌分三大類群：( 1 )厭氧發(fā)酵型：芽孢梭菌屬(Clostridium ) 、牛黃瘤胃球菌屬( Ruminococcus) 、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus) 、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌(Bacteroides succinogeneS、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿 菌 ( Fibrobactersuccinogenes )、 溶 纖 維 菌( Butyrivibrio fibriso

2、lvens )、 熱 纖 梭 菌( Clostridium thermocellum )、 解 纖 維 梭 菌( Clostridiumcellulolyticum ) ；( 2)好氧型：糞堿纖維單胞菌(Cellulomonasfimi) 、纖維單胞菌屬( Cellulomonas) 、纖維弧菌屬(Cellvibrio ) 、發(fā)酵單胞菌( Zymomonas) 、混合纖維弧菌(Cellvibrimixtus ) ；( 3)好氧滑動菌，如噬胞菌屬(Cytophaga) 。4 細(xì)菌纖維素酶分類細(xì)菌纖維素酶是多酶復(fù)合體系，根據(jù)各酶的功能可分為三大類：(1 ) 內(nèi) 切 葡 聚 糖 酶 ( 1,4-D-

3、glueanohydrolase 或endo-1,4-&D-glucanase, EC 321.4),簡稱 Cen。作用于纖維 素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解&1,4-糖昔鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素，其分子量大 小約為23-146KD。(2)外切葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-bD-glucan cellobio-hydrolase 或 exo-1,4-&D- glucanase,EC3. 2.1.91,簡稱 Cex。作用于纖維 素線狀分子末端，水解 川, 4-D-14糖昔鍵，依次切下一個纖 維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶(cellobi

4、ohydrolase) ，分子量約38-118 KD。(3) &葡萄糖甘酶(&1,4-glucosidase, EC3.2.1.21 簡稱 BG 或稱纖 維二糖酶。這類酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子，其分子量約為76KD 。5 細(xì)菌纖維素酶水解機制好氧細(xì)菌的三種纖維素酶是以各自獨立的形式分泌到細(xì)胞外水解纖維素的；厭氧細(xì)菌的三種纖維素酶以多酶復(fù)合體形式結(jié)合在細(xì)胞壁上對纖維素進行水解。細(xì)菌纖維素酶通過多酶復(fù) 合體系各組分協(xié)同作用徹底有效降解天然纖維素。Cen負(fù)責(zé)進攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解& 1,4 -糖甘鍵，將長鍵纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末

5、端的小分子纖維素Cex負(fù)責(zé)從纖維素線狀分子的非還原性末端水解切下纖維二糖單位BG則將纖維二糖水解成葡萄糖在已知結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素酶分子中，通過在異頭碳原子位 通過構(gòu)型的保留或構(gòu)型的轉(zhuǎn)化完成催化反應(yīng)，其中兩個保守的 竣基氨基酸分別作為質(zhì)子供體和親核試劑，如C . thernmocellum的內(nèi)切酶CelC催化域中Glu-280和Glu-140分別作親核試劑和 質(zhì)子供體，C .fimi的外切酶Cex的Glu-574和Glu-645分別作親 核試劑和質(zhì)子供體，證明了細(xì)菌纖維素酶降解纖維素的水解雙 置換機制。由于纖維素底物的高度復(fù)雜性以及底物的多樣性， 纖維素水解過程的并沒有完全清楚。因此，纖維素酶系的

6、降解 機理還有待進一步研究和探討。6細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能通過對糞堿纖維單胞菌（Cellulomonas fimi）的一個外切酶 Cex 和一個內(nèi)切酶CenA的研究表明，細(xì)菌纖維素酶的纖維素結(jié)合結(jié) 構(gòu)域（CBD）位于氨基端或竣基端，它借助連接橋（Linker）與 催化結(jié)構(gòu)域（CD）連接。在多種細(xì)菌的纖維素酶中發(fā)現(xiàn)有相似 的結(jié)構(gòu)。催化結(jié)構(gòu)域（CD）纖維素酶分子的催化結(jié)構(gòu)域主要體現(xiàn)酶的催化活性及對特 定水溶性底物的特異性。不同 來源纖維素酶分子量差別很大，但 其催化區(qū)的大小卻基本一致，活性位點的三級結(jié)構(gòu)都是保守區(qū)域。Juy M et等采用x光衍射的方法對熱纖梭菌的 Cel D的催化域進行了結(jié)晶和

7、解析。結(jié)果表明，內(nèi)切酶的活性位點位于一個開放的“裂縫"（Cleft）中，可與纖維素鏈的任何部位結(jié)合并切斷纖維素鏈；外切酶的活性位點位于一個長 環(huán)"（loop）所形成的 內(nèi)部通道” （tunnel）里，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。細(xì)菌的外切酶有兩個酶切位點，有限酶切時，可將CBD 和連接橋分別切去。Meinke A等利用蛋白質(zhì)工程的方法將糞堿纖維單胞菌的外切酶Cbh A分子的Loop刪除后，發(fā)現(xiàn)該酶的內(nèi)切酶活性提高。根據(jù)其氨基酸序列的相似性已知的纖維素酶的CD 可分為 70 多個家族，在同一家族內(nèi)具有相似的分子折疊模式和保守的活性位點，因此在同一家族內(nèi)，其反應(yīng)

8、機制和對底物的特異性都可能相同，這已通過實驗得到證實。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）許多纖維素酶主要依靠在肽鏈N 端或 C 端的 CBD 結(jié)合底物，該結(jié)構(gòu)又稱纖維素結(jié)合模塊，其功能是將相鄰的催化結(jié)構(gòu)域傳遞到晶體纖維素底物上。細(xì)菌纖維素酶的CBD 由 100-110個氨基酸組成，同源性較低。細(xì)菌CBD 平坦的表面只露出2 個或 3 個芳香族氨基酸殘基和一些形成氫鍵的殘基,多項研究證實，這些殘基與CBD 對結(jié)晶纖維素的結(jié)合有關(guān)。一些細(xì)菌的CBD 結(jié)構(gòu)有一定的共同特點：帶電荷氨基酸含量很低；羥基氨基酸含量很高；都含有Trp、Asn和Gly,而且兩個Cys在N、C末端的位置完全相同。汪天虹等用多維核磁共振

9、和X射線衍射技術(shù)，證實了族H C. Fimi Cex、Cen 以及族m C. thermocelhun Cip 的 CBD 有相似的結(jié)構(gòu)：由2個B片層面對面折疊在一起，形成一個B三明治結(jié)構(gòu)，CBDcex含有一個單一的二硫橋連接N-末端和C-末端，CBDcip有一個Ca2+的高親和性結(jié)合位點6。然而，有的CBD的作用似乎不在于跟底物結(jié)合，而是破壞晶體纖維素鏈間的非共價相互作用；或者不僅結(jié)合底物，還提供結(jié)合不同底物結(jié)構(gòu)的優(yōu)先權(quán)。楊永彬等通過實驗證實家族H的 CBD能夠促使纖維素中氫鍵的斷裂，從而釋放單根纖維素分子鏈7。C.fimi的CenA或Cex單獨的 CBD 不具備對纖維素的水解活力，但能破壞

10、棉纖維，形成短纖維，具有疏解結(jié)晶纖維素的能力。實驗證明，細(xì)菌纖維素酶中的 CBD 對酶的催化活力是非必需的，但它們具有調(diào)節(jié)酶對可溶性和非可溶性底物專一性活力的作用。連接橋（1inker）連接肽（inker） 一級結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌纖維素酶分子的連接肽富含脯氨酸（Pro）和絲氨酸（Thr）,完全由Pro-Thr這樣的重復(fù)序列約100 多個氨基酸殘基組成。在高級結(jié)構(gòu)的分子形狀上，細(xì)菌連接肽、CD、CBD之間呈135°。連接肽的作用可能是保持 CD 和 CBD 之間的距離，有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體。纖維素酶降解纖維素是酶的各組分之間協(xié)同作用的結(jié)果，目前主要有2種觀點：一種觀

11、點認(rèn)為，首先由EGS纖維素分子內(nèi)部的無定形區(qū)進行酶切產(chǎn)生新的末端，然后由CBHZ纖維二糖為單位由末端進行水解， 每次切下1個纖維二糖分子，最后由BG各纖維二糖以及短鏈的纖維寡 糖水解為葡萄糖。另一種觀點則認(rèn)為，首先是由 CB冰解不溶性纖維 素生成可溶性的纖維糊精和纖維二糖，然后由EG乍用于纖維糊精生成 纖維二糖，再由BG各纖維二糖分解成2個葡萄糖。這種協(xié)同作用方式 也決定了纖維素酶表達調(diào)控的復(fù)雜性。7 細(xì)菌纖維素酶基因的克隆與表達細(xì)菌中編碼纖維素酶的基因在基因組的分布為隨機的或形成基因簇。在基因簇中，有轉(zhuǎn)錄終止子，沒發(fā)現(xiàn)有啟動子。人們已從 40 多種細(xì)菌中克隆到了纖維素酶基因，其中一些酶基因已

12、經(jīng)在大腸桿菌和酵母中得到表達。如從Stropyomyces、Clostridium 、 Thermoanaer obacte、r Themomonspora、 Erwinia、 Pseudomonas、 Cellvibrio 、 Ruminococcus、 Cellulomonas 、 Fibrobacter 和 Bacillus 中成功分離出葡聚糖基因，并先后克隆了 瘤 胃 的 Bacteroides 、 succi nogenes 、 Butyrivibrio sp Ruminococcus albus 等細(xì)菌的纖維素酶基因，同時熱梭菌中的11 種內(nèi)切纖維素酶（CelA、 CelB、 Ce

13、lD、 CelE、CelF、CelG、CelH、Cell、CelJ、CelK、CelS）的基因已經(jīng)被 克隆，嗜纖維梭菌的5 種內(nèi)切纖維素酶（EngA、 EngB、 EngC、EngD、 EngE） 已經(jīng)測序并在大腸桿菌中得到表達。不同的細(xì)菌中 克 隆 了 內(nèi) 切 葡 聚 糖 酶 基 因 。 Kim 等 克 隆 了 Aquifex aeolicus VF5 編碼 EG 的 ce18Y基因，在 E.coli XL1 -Blue 中成功表達，Hakamada 等運用盒式連接介導(dǎo)PCR 和反向PCR克隆到了基因egl-257。人們將纖維素酶、纖維二糖等外源 基因轉(zhuǎn)入運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas

14、mobilis)中并得到不同 程度的表達，有望將它改造為能將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的重組菌株并在工業(yè)中廣泛應(yīng)用。細(xì)菌葡聚糖酶基因在S.cerevisiae的啟 動子和信號肽的控制下構(gòu)建在同一質(zhì)粒載體上，然后轉(zhuǎn)入S.cerevisiae， 重組菌可向培養(yǎng)基分泌保留70%活性的葡聚糖內(nèi)切酶和外切酶，這種酶能夠分解濾紙和木漿中的纖維素。7 展望細(xì)菌以多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)徹底有效降解天然纖維素，纖維小體是研究較多的細(xì)菌纖維素酶復(fù)合體。纖維小體的作用方式是理解纖維素降解和利用纖維素資源的關(guān)鍵。進一步了解纖維小體結(jié)構(gòu)的普遍性，不同來源的纖維小體的組成同源性和多樣性，纖維小體蛋白質(zhì)之間的相互作用，纖維小體組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生等，從而為工程改造纖維小體，利用纖維素資