基因重組與基因工程概述

1、第十四章第十四章 基因重組與基因工程基因重組與基因工程姚真真姚真真生物化學與分子生物學教研室生物化學與分子生物學教研室Gene recombination & Gene engineering中心法則中心法則 逆逆轉錄轉錄轉錄轉錄RNA翻譯翻譯蛋白質蛋白質復制復制DNA生物體生物體環(huán)境環(huán)境 基因的表達調控基因的表達調控 適應環(huán)境適應環(huán)境了解中心法則了解中心法則 對天然的對天然的DNA進行改造進行改造為人類服務為人類服務基因工程基因工程 即即DNADNA重組技術。在分子水平重組技術。在分子水平上進行遺傳操作，上進行遺傳操作，按設計的藍圖按設計的藍圖，從供體中提取或人工合成從供體中提取或人

2、工合成目的基因目的基因，使其與載體構建成重組使其與載體構建成重組DNADNA，再轉再轉移到受體細胞。移到受體細胞。目的基因目的基因在受體細在受體細胞中表達，獲得新的遺傳性狀胞中表達，獲得新的遺傳性狀 。 基因工程基因工程熒光蛋白酶基因熒光蛋白酶基因乳汁中分泌人凝血因子的乳汁中分泌人凝血因子的轉基因山羊轉基因山羊乳汁中乳汁中分泌分泌人蛋白人蛋白因子因子的的轉基因轉基因豬豬主要內容主要內容DNA重組重組重組重組DNA技術技術重組重組DNA與醫(yī)學的關系與醫(yī)學的關系 不同不同DNA之間發(fā)生共價連接形成新之間發(fā)生共價連接形成新的的DNA 分子。分子。 基因移動和重組是生物界普遍現(xiàn)象，基因移動和重組是生物

3、界普遍現(xiàn)象，是生物進化的動力，是生物進化的動力，DNA重組具有重組具有重要的生物學意義重要的生物學意義DNA重組概念重組概念第一節(jié)第一節(jié) DNA重組重組DNADNA重組的類型重組的類型位點特異性重組位點特異性重組（site-specific recombination）接合接合(conjugation) 轉化轉化(tranformation) 轉導轉導(transduction)同源重組同源重組（homologous recombination）轉座重組轉座重組（transposition recombination ）細菌的基因轉移與重組細菌的基因轉移與重組一、細菌的基因轉移與重組一、細菌的

4、基因轉移與重組 接合接合(conjugation) 轉化轉化(tranformation) 轉導轉導(transduction)（一）接合作用（一）接合作用 (conjugation ) 指通過細胞的指通過細胞的直接直接接觸接觸( (如菌毛如菌毛) ) ，遺傳信息從供體細胞遺傳信息從供體細胞單向轉移單向轉移到受到受體細胞的過程。體細胞的過程。接合接合轉移轉移F因子因子染色體染色體DNA性鞭毛性鞭毛Griffith 肺炎球菌轉化實驗肺炎球菌轉化實驗（二）轉化（二）轉化（transformation） 相關概念：相關概念：轉化：轉化：細胞從周圍介質中吸收裸露細胞從周圍介質中吸收裸露 的的DNA,而

5、獲得新的遺傳表型。而獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細胞（感受態(tài)細胞（competent cell）: 具有攝取周圍介質中游離具有攝取周圍介質中游離DNA 分子能力的細菌細胞。分子能力的細菌細胞。 轉化過程：轉化過程：DNA片斷細菌細菌攝取攝取DNA片斷片斷重組重組細菌性狀改變細菌性狀改變（三）轉導（三）轉導（transduction）通過病毒（噬菌體）介導發(fā)生在供通過病毒（噬菌體）介導發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的體細胞與受體細胞之間的DNADNA轉移轉移和重組過程。和重組過程。溶溶 菌菌感感 染染重重 組組感感 染染細細 菌菌噬菌體噬菌體 轉導轉導噬菌體感染宿主噬菌體感染宿主后的兩種結局后的兩種結

6、局cI基因基因cro基因基因溶原狀態(tài)溶原狀態(tài)cI基因基因cro基因基因溶菌狀態(tài)溶菌狀態(tài)噬菌體感染宿主菌后的兩種狀態(tài)是由噬菌體的噬菌體感染宿主菌后的兩種狀態(tài)是由噬菌體的cI和和cro兩個基因編碼調控蛋白控制的，溶原狀態(tài)，兩個基因編碼調控蛋白控制的，溶原狀態(tài)， cI 表達；溶菌狀態(tài)，表達；溶菌狀態(tài)， cro 表達。除了控制其他基表達。除了控制其他基因表達外，因表達外， cI和和cro兩個基因編碼調控蛋白是互為兩個基因編碼調控蛋白是互為阻遏蛋白。阻遏蛋白。結合協(xié)同cI基因基因cro基因基因溶原狀態(tài)溶原狀態(tài)cI基因基因cro基因基因溶菌狀態(tài)溶菌狀態(tài)思考：思考：當含噬菌體的細菌用紫外線輕度當含噬菌體的細

7、菌用紫外線輕度照射后，照射后，cI蛋白被降解蛋白被降解,接下去會發(fā)生什接下去會發(fā)生什么？停止照射后會怎樣？為什么會進化么？停止照射后會怎樣？為什么會進化成這種機制？成這種機制？結合協(xié)同 二、同源重組二、同源重組（homologous recombination） 不需要特異不需要特異DNA序列，而是依賴兩分子之間序列，而是依賴兩分子之間序列的相同或相似性而進行的重組。序列的相同或相似性而進行的重組。同源序列愈長，同源重組率愈高，反之，則同源序列愈長，同源重組率愈高，反之，則不易發(fā)生重組。不易發(fā)生重組。 概念概念同源重組意義同源重組意義同源重組發(fā)生在任何生物中。同源重組發(fā)生在任何生物中。細菌如果

8、通過接合或轉化獲得的外源細菌如果通過接合或轉化獲得的外源DNA與宿主與宿主DNA充分同源，那末外源充分同源，那末外源DNA就可以整合進宿主的染色體。就可以整合進宿主的染色體。同源重組也是同源重組也是DNA損傷修復的重要機制損傷修復的重要機制Electron micrograph of a Holliday JunctionHolliday Junction (A) The structure of a Holliday junction bound by Cre recombinase (gray), a bacteriophage protein. (B) A schematic view

9、of a Holliday junction. 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 分支遷移分支遷移 (recA)5 3 5 3 5 3 5 3 內切酶內切酶 (recBCD)5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 5 內切酶內切酶(recBCD)5 3 3 3 DNA侵擾侵擾(recA)3 5 5 3 5 3 5 3 DNA 連接酶連接酶Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 E. coli 的同源重組過程：的同源重組過程：5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 3 5 5 5 5 3 3 3 內切酶內切酶(ruvC

10、)內切酶內切酶(ruvC)5 5 5 5 3 3 3 3 5 3 5 5 5 3 3 3 DNA連接酶連接酶3 5 5 5 5 3 3 3 拼接重組體拼接重組體 DNA連接酶連接酶5 5 5 5 3 3 3 3 片段重組體片段重組體Holliday模型同源重組步驟模型同源重組步驟兩個同源染色體兩個同源染色體DNA排列整齊排列整齊一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成對應的鏈連接，形成Holliday中間體中間體通過分支移動產生異源雙鏈通過分支移動產生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體重

11、組體DNA，分別為：分別為：片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 片段重組體片段重組體 （見模型圖（見模型圖右右邊產物）：邊產物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。5 5 5 5 3 3 3 3 片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體（見模型圖（見模型圖左左邊產物）：邊產物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本雙鏈區(qū)的兩

12、側來自不同親本DNA。 3 5 5 5 5 3 3 3 拼接重組體拼接重組體 位點特異性重組：位點特異性重組：由整合酶催化，在兩個由整合酶催化，在兩個DNA位點特異的短序列之間發(fā)生的切割和連位點特異的短序列之間發(fā)生的切割和連接反應接反應:l 噬菌體噬菌體DNA整合整合l細菌特異位點重組細菌特異位點重組l免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排三、位點特異性重組三、位點特異性重組（一）（一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉反轉錄病毒整

13、合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒錄病毒cDNA的的長末端重復序列長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)。 attPattBE. coli DNAInt, IHFInt, IHF , Xis DNA噬菌體噬菌體DNA的的整合和切除整合和切除att: attachment site, Int: integrase, IHF: integration host factor, Xis: excisionasePOPBOBBOPPOBattLattR整合整合切除切除hix為反向重復序列，它們之間的為反向重復序列，它們之間的H片片段可在段可在Hin控制下進行特異位點重組控制

14、下進行特異位點重組(倒位倒位)。H片段上有兩個啟動子片段上有兩個啟動子P，其一驅動其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動基因表達，另一正向時驅動H2和和rH1基因表基因表達，反向達，反向(倒位倒位)時時H2和和rH1不表達。不表達。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。（二）細菌的特異位點重組（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌沙門氏菌H H片段片段特異位點重組特異位點重組(倒位倒位) )決定鞭毛相轉變決定鞭毛相轉變DNAH片段片段 h1H2與阻遏基因與阻遏基因mRNAHin重組酶重組酶H2鞭毛素鞭毛素阻遏蛋白阻遏蛋白(a) hinh2阻遏基因阻遏基因rh1啟動序列啟動序列hinmRNAP

15、Phixhix hinh2阻遏基因阻遏基因rh1H片段倒位片段倒位 h1hin mRNAH1 mRNAHin重組酶重組酶H1鞭毛素鞭毛素(b) hinPP沙門氏菌沙門氏菌H H片段片段特異位點重組特異位點重組(倒位倒位) )決定鞭毛相轉變決定鞭毛相轉變（二）細菌的特異位點重組（二）細菌的特異位點重組（三）、免疫球蛋白基因的重排（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩和兩條重鏈條重鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個獨立的基因組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈族編碼，其中兩個編碼輕鏈( 和和 )，一個編，一個編碼重鏈。碼重鏈。 輕鏈的基

16、因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C The organization of mouse immunoglobulin gene segments. The organization in germline cells is shown on the left, and the rearranged organization characteristic of mature B lymphocytes is shown to the right of the arrows. The rearranged states shown are b

17、ut single examples of the many possibilities for each gene family. Consensus elements are located above and below germline variable-region genes that recombine to form genes encoding immuno-globulin chains. These consensus elements are complementary and are arranged in a heptamer-nonamer, 12-bp to 2

18、3-bp spacer pattern. -Chain -Chain H-Chain231223122312 CACAGTG ACAAAAACC ACAAAAAACC CACAGTG此重排的重組酶基因此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共共有兩個，分別產生蛋白質有兩個，分別產生蛋白質RAG1和和RAG2。RAG1 識別九核識別九核苷酸序列，苷酸序列，RAG2 加入復合物，切割七核苷酸序列位點等加入復合物，切割七核苷酸序列位點等 CACAGTG ACAAAAACC GTGTCAC TGTTTTTGG 7 核苷酸序列核苷酸序列 12/23間隔序列

19、間隔序列 9核苷酸序列核苷酸序列重組信號序列（重組信號序列（RSS）重排機制：重排機制：重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基因的基因的V-J重排均發(fā)生重排均發(fā)生在特異位點上。在在特異位點上。在V片段的下游，片段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的片段的兩側均存在保守的重組信號序列兩側均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHHOVJ單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應分子內轉酯反應單鏈切開單鏈切開轉移核苷酸轉移核苷酸修復、連接修復、連

20、接免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程-OH親核攻擊親核攻擊四四 轉座重組轉座重組（transpositiontransposition）由插入序列和轉座子介導的基因轉移或重排。由插入序列和轉座子介導的基因轉移或重排。 許多數(shù)細菌基因組含有幾十個拷貝的能轉許多數(shù)細菌基因組含有幾十個拷貝的能轉座座DNA片段，片段長度從幾百到幾萬個片段，片段長度從幾百到幾萬個bp,是遺傳多樣性的一個重要來源。是遺傳多樣性的一個重要來源。轉座重組分類：轉座重組分類：插入序列插入序列 ( insertion sequence，IS )轉座轉座: 由轉座酶（由轉座酶（transposase）、）、一個分離的反向

21、重復序一個分離的反向重復序（inverted repests）列和側翼二個正向重復序列（列和側翼二個正向重復序列（direct repeats）組成。組成。 發(fā)生形式：發(fā)生形式： 保守性轉座保守性轉座( (conservative transposition)conservative transposition) 復制性轉座復制性轉座( (duplicative transposition)duplicative transposition) 轉座子（轉座子（transposon，Tn）轉座：轉座： 除了有插入序列的除了有插入序列的 結構外，還帶有抗性或其他標記基因。結構外，還帶有抗性或其他標

22、記基因。轉座序列結構轉座序列結構反向重復序列反向重復序列反向重復序列轉座酶基因IS轉座酶基因ampR反向重復序列Tn3轉座酶基因tetRTn10IS細菌中的三種轉座子類型插入序列的復制性轉座插入序列的復制性轉座轉座子轉座子(transposons) 可從一個染色體位可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。點轉移到另一位點的分散重復序列。 轉座子組成：轉座子組成：反向重復序列反向重復序列轉座酶編碼基因轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因轉座子轉座轉座子轉座由轉座子介導的轉座由轉座子介導的轉座Exon shuff

23、ling by transposition. (a) Transposition of an exon flanked by homologous DNA transposons into an intron on a second gene. transposase can recognize and cleave the DNA at the ends of the transposon inverted repeats. In gene 1, if the transposase cleaves at the left end of the transposon on the left

24、and at the right end of the transposon on the right, it can transpose all the intervening DNA, including the exon from gene 1, to a new site in an intron of gene 2. The net result is an insertion of the exon from gene 1 into gene 2. 轉座子轉座轉座子轉座-外顯子重組（混編）外顯子重組（混編） 外顯子混編（外顯子混編（ Exon shuffling ）：）：產生許多新

25、功能產生許多新功能的蛋白質的蛋白質外顯子混編是生物進化的一個重要過程，得益于真核生物外顯子混編是生物進化的一個重要過程，得益于真核生物DNA編碼序列的組織方式：斷裂基因含有長長的內含子，含有許多編碼序列的組織方式：斷裂基因含有長長的內含子，含有許多的重復序列，并處于外顯子的兩側。因此，內含子的存在提供的重復序列，并處于外顯子的兩側。因此，內含子的存在提供了外顯子混編的基礎。有人提出人基因組編碼的約了外顯子混編的基礎。有人提出人基因組編碼的約6萬種蛋白萬種蛋白質是從幾千個獨立的外顯子混編而來。質是從幾千個獨立的外顯子混編而來。第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNADNA技術技術重組重組DNA技術相關概念及

26、意義技術相關概念及意義重組重組DNA技術的原理及過程技術的原理及過程重組重組DNA技術與醫(yī)學關系技術與醫(yī)學關系一、重組一、重組DNA技術相關概念及意義技術相關概念及意義 （一）有關（一）有關DNA克隆的相關概念克隆的相關概念克隆克?。╟lone）: 通過無性繁殖過程所產生的與親代通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體，這一群體可以是分子、細胞、完全相同的子代群體，這一群體可以是分子、細胞、動物或植物等。獲取這一群體的過程稱為動物或植物等。獲取這一群體的過程稱為克隆化克隆化（cloning）DNA克隆克隆(DNA cloning ) ： 是按人類的意愿，在體是按人類的意愿，在體外對外對

27、DNA分子進行重組，再將重組分子導入受體細分子進行重組，再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA分子分子的大量拷貝。又稱的大量拷貝。又稱分子克隆分子克隆 （molecular cloning)，基因克隆（基因克?。╣ene cloning）、）、重組重組DNA ( recombinant DNA) 。重組重組DNA技術技術(recombinant DNA technology)：是指實現(xiàn)基因（或是指實現(xiàn)基因（或DNA）克隆所采用的方法及技術路線等。又稱克隆所采用的方法及技術路線等。又稱基因工程（基因工程（gene engineerin

28、g），），遺傳工遺傳工程程（genetic engineering）等。等。（二）重組（二）重組DNADNA技術的意義技術的意義填平了物種間不可逾越的鴻溝；填平了物種間不可逾越的鴻溝；縮短進化時間；縮短進化時間；對生物定向改造；對生物定向改造；基因結構、結構功能及調控研究的基礎；基因結構、結構功能及調控研究的基礎；疾病診治疾病診治二、重組二、重組DNA技術的原理及過程技術的原理及過程基本過程：基本過程：分分切切接接轉轉篩篩（一）工具（一）工具酶酶 工工具酶具酶：系系指能用于指能用于DNA和和RNA分子分子的的切割切割，連接連接，聚合聚合，反反轉錄轉錄等等有關有關的的酶酶系系統(tǒng)統(tǒng)稱為工具稱為工具

29、酶酶。常常 用用 的的 工工 具具 酶酶 限制性內切核酸酶限制性內切核酸酶 (restriction endonucleases) DNA連接酶連接酶 (DNA ligase) DNA聚合酶聚合酶I (DNA polymerase I) 多核苷酸激酶多核苷酸激酶 (polynucleotide kinase) 反轉錄酶反轉錄酶 (reverse transcriptase) DNA末端轉移酶末端轉移酶 (DNA terminal transferase) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 在在DNA分子內部的特異性的堿基序列內部進行分子內部的特異性的堿基序列內

30、部進行切割切割 將兩條以上的線性將兩條以上的線性DNA分子或片段分子或片段 催化形成磷催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體酸二酯鍵連接成一個整體 催化催化DNA 切口平移反應，制備高比活探針；切口平移反應，制備高比活探針； DNA末端標記，合成末端標記，合成cDNA的第二鏈的第二鏈 催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的 5OH末端上末端上 以以RNA為模板合成互補的為模板合成互補的cDNA鏈鏈 線性雙鏈線性雙鏈 或單鏈或單鏈DNA分子的分子的3OH末端末端加上同加上同聚物尾聚物尾 去除去除DNA,RNA,dNTP的的5末端的末端的磷酸基團磷酸基團工工 具具 酶酶

31、 主主 要要 功功 能能1、限制性核酸內切酶、限制性核酸內切酶（restriction endonuclease） 定義定義：是一類能識別和切割雙鏈：是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定分子中特定堿基序列的核酸水解酶。堿基序列的核酸水解酶。分類分類vI 型：復合功能酶內切型：復合功能酶內切(識別位點周圍識別位點周圍400-700 bp)、甲基化、甲基化、ATP酶和酶和DNA解旋；解旋；vIII型：內切型：內切(識別位點周圍識別位點周圍25-30 bp) 、甲基化甲基化vII 型：識別和切割雙鏈型：識別和切割雙鏈DNA的特異順序的特異順序(識別識別位點內位點內)命名：根據(jù)酶的微生物學名命名：命

32、名：根據(jù)酶的微生物學名命名： 如：如：Escherichia coli, R株中幾種限制酶：株中幾種限制酶： EcoR I，EcoR II，EcoR V第一字母（大寫，斜體），示該酶微生物第一字母（大寫，斜體），示該酶微生物屬屬名；名；第二、三字母（小寫，斜體），示該酶微生物第二、三字母（小寫，斜體），示該酶微生物種種名；名；第四字母（大寫，斜體），示該酶微生物第四字母（大寫，斜體），示該酶微生物株或株或型型；如一種菌株中有多種限制性內切酶，用羅馬數(shù)字如一種菌株中有多種限制性內切酶，用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)分離的先后順序。表示發(fā)現(xiàn)分離的先后順序。II型限制性內切酶的作用特點型限制性內切酶的作用特點識

33、別序列個堿基，識別序列個堿基，4個核苷酸序列，個核苷酸序列，則每則每（）個堿基出現(xiàn)一個靶序列；（）個堿基出現(xiàn)一個靶序列；6個核苷酸序列出現(xiàn)的間隔是個核苷酸序列出現(xiàn)的間隔是4kb, 8個核苷個核苷酸序列則是酸序列則是65kb 。回文結構回文結構（palindrome）三種不同的切口：平末三種不同的切口：平末(blunt end) 端、端、 突出粘性末端突出粘性末端(cohensive end or stick ) 突出粘性末端突出粘性末端限制性核酸內切酶三種切口限制性核酸內切酶三種切口產生產生5突出粘性末端（突出粘性末端（sticky end):以以EcoR I為例：為例： 5-G AATTC-

34、3 5-GP OHAATTC-3 3-CTTAA G-5 EcoR I 3-CTTAAOH PG-5產生產生3突出粘性末端突出粘性末端:以以Pst I為例：為例： 5-CTGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3 3-G ACGTC-5 Pst I 3-GOH p ACGTC-5產生平末端（產生平末端（blunt end): 以以Nru I為例：為例： 5-TCG CGA-3 5-TCGp OHCGA-3 3-AGC GCT-5 Nru I 3-AGCOH pGCT-5II型限制性內切酶的用途：型限制性內切酶的用途： DNA克隆克隆 DNA雜交與序列分析雜交與序列分析 改建質粒改建質粒 構

35、建基因組圖譜和文庫構建基因組圖譜和文庫限制與修飾系統(tǒng)（限制與修飾系統(tǒng)（ restriction modification ，R-M系統(tǒng)）：系統(tǒng)）： 甲基化酶與相關的甲基化酶與相關的II型限制性內切酶組成，型限制性內切酶組成，它們識別相同序列，發(fā)揮不同功能。它們識別相同序列，發(fā)揮不同功能。 如：如：EcoRI restriction endonuclease和和 EcoRI methylaserestriction modification (a) EcoRI, a restriction enzyme from E. coli, makes staggered cuts at the spec

36、ific 6-bp inverted repeat sequence shown. This cleavage yields fragments with single-stranded, complementary “sticky” ends. Many other restriction enzymes also produce fragments with sticky ends. (b) Bacterial cells with restriction endonucleases also contain corresponding modification enzymes that

37、methylate bases in the restriction-recognition site. For example, E. coli cells containing the EcoRI restriction enzyme also contain EcoRI methylase, a modification enzyme that catalyzes addition of a methyl group to two adenines in the EcoRI recognition sequence. The methylated restriction site is

38、not cleaved by EcoRI, assuring that a cell making this restriction enzyme does not destroy its own DNA. 2、DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerases）能合成能合成DNA的酶稱的酶稱DNA聚合酶。常用的酶：聚合酶。常用的酶：大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶及其大片斷（及其大片斷（Klenow片段）片段）Taq DNA聚合酶聚合酶反（逆）轉錄酶反（逆）轉錄酶末端脫氧核糖核酶轉移酶（末端轉移酶）末端脫氧核糖核酶轉移酶（末端轉移酶）(1) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 5 3外切

39、酶外切酶 53聚合酶聚合酶 3 5外外切酶切酶枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶Klenow 片段片段作用特點：作用特點：多功能酶：多功能酶：53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性主要用途主要用途: 催化催化DNA 切口平移反應，制備高比活探切口平移反應，制備高比活探針；針； DNA測序、合成測序、合成cDNA第二鏈，及第二鏈，及DNA末端標末端標記（記（Klenow片段）片段）555555DNA酶酶 IDNA聚合酶聚合酶I（全酶）全酶）利用大腸桿菌利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I進行切口平移法進行切口平移法Mg 2+dATP dCTP dGTP-32P dT

40、TPT*T*T*T*T*T*55555555限制性內切酶限制性內切酶Klenow 片段片段-32P dNTP變性變性3末端末端32P標記的標記的單鏈單鏈DNA探針探針利用利用Klenow片斷進行片斷進行3端標端標記記5末端末端突出的突出的DNA（2）Taq DNA聚合酶聚合酶 1988年年saiki在嗜熱水生菌在嗜熱水生菌(thermus aquaticus)分離出分離出耐熱耐熱的依賴于的依賴于DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，MW=65kD，主要應用于聚合酶主要應用于聚合酶鏈反應（鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）中對中對DNA分子的特定序列進行體外擴增分子

41、的特定序列進行體外擴增（3）反轉錄酶）反轉錄酶 (reverse transcriptase) 亦稱依賴于亦稱依賴于RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RDDP)催化以催化以RNA為模板的為模板的DNA聚合反應，以聚合反應，以mRNA為為模板，催化合成出互補的模板，催化合成出互補的DNA，稱為稱為cDNA (com -plementary DNA)。主要用于主要用于cDNA文庫的構建。文庫的構建。35外切酶活性（又稱外切酶活性（又稱RNA酶酶H活性），特異性活性），特異性降解降解RNA-DNA雜交分子中的雜交分子中的RNA部分部分（4 4）末端脫氧核糖核酸轉移酶）末端脫氧核糖核酸轉移酶（末端轉移（

42、末端轉移酶酶, terminal , terminal transferasetransferase）催化作用：催化作用：在二價陽離子存在下，它催化在二價陽離子存在下，它催化dNTP加到加到DNA分子的分子的3羥基端。羥基端。用途：用途：l用于給載體或用于給載體或cDNA加上互補的多聚體尾巴，加上互補的多聚體尾巴，造成便于重組的人工粘性末端；造成便于重組的人工粘性末端；l用于用于DNA片斷片斷3-末端標記。末端標記。AAAAAn 3 mRNAA A A AAn 3 mRNAT T T T 5 cDNAT T T T 5GGGGGGGGT T T T 55CCCCA A AAOligo(dT)引

43、物引物反轉錄酶反轉錄酶dNTPOligo (dC) 引物引物Taq DNA 聚合物聚合物（或（或Klenow 片段）片段）dNTP去除去除mRNA鏈鏈加加oligo(dG)末端轉移酶末端轉移酶cDNA雙鏈雙鏈全長雙鏈全長雙鏈 cDNAcDNA的合成的合成5533333、DNA連接酶連接酶(ligase) 催化兩個獨立催化兩個獨立DNA片段的片段的5磷酸基與磷酸基與3羥基之間形羥基之間形成磷酸二酯鍵，使成磷酸二酯鍵，使DNA片片段拼接起來段拼接起來T4連接酶連接酶：粘性末端和平：粘性末端和平末端；末端；大腸桿菌連接酶大腸桿菌連接酶：粘性末：粘性末端端4 4、多核苷酸激酶（、多核苷酸激酶（poly

44、nucleotide polynucleotide kinasekinase） 寡核苷酸探針標記；用于連接反應，使缺寡核苷酸探針標記；用于連接反應，使缺 少少端端磷酸的磷酸的DNA片段合成接頭磷酸化片段合成接頭磷酸化N N N N NHOAd-P-P-P5 3N N N N NP5 3 +Ad-P-P+ - 32PATPADP寡核苷酸片段寡核苷酸片段32P標記的標記的寡寡核苷酸片段核苷酸片段多核苷酸激酶多核苷酸激酶（二）基因載體（二）基因載體（vectorvector） 載體（載體（vector）：攜帶目的攜帶目的DNA片段進入宿片段進入宿主細胞進行擴增和主細胞進行擴增和/或表達的一類或表達的

45、一類DNA分子。分子。載體特征：載體特征：l自主復制自主復制 即有復制原點（必需）即有復制原點（必需）l酶切位點（必需）酶切位點（必需）l大小適合大小適合l篩選標記篩選標記: 如抗藥性、營養(yǎng)標記、如抗藥性、營養(yǎng)標記、 -半乳糖半乳糖苷酶顯色反應等苷酶顯色反應等l拷貝數(shù)高拷貝數(shù)高 載體類型載體類型：l來源來源: 質粒；噬菌體；病毒質粒；噬菌體；病毒, 酵母人工染色酵母人工染色體體l功能功能: 克隆載型體和表達型載體克隆載型體和表達型載體l受體細胞受體細胞: 原核細胞載體、真核細胞載體和原核細胞載體、真核細胞載體和穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector）u質粒（質粒（plasmid）：細

46、菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA。u質粒復制的類型質粒復制的類型：嚴緊型：嚴緊型：1-5拷貝，與細菌復制密切相關拷貝，與細菌復制密切相關松弛型：松弛型：10-200拷貝以上拷貝以上u常用載體常用載體：pBR322：4.36kb；人工構建人工構建 ；Tetr和和Ampr；多克隆位多克隆位點，松弛型點，松弛型pUC系列質粒：系列質粒： pBR322和和M13噬菌體改建噬菌體改建, 2.674kb；Ampr；藍白斑篩選（藍白斑篩選（lacZ， -肽）；高拷貝（肽）；高拷貝（500-700）1 1、質粒載體、質粒載體u用途用途：保存與擴增保存與擴增 2kb的目的基因的目的基因構建構

47、建cDNA文庫文庫測序測序制備探針制備探針復制點：復制點：ori篩選標記篩選標記：ampr,tetr克隆位點克隆位點：多個單一：多個單一限制性內切酶位點限制性內切酶位點2 2、噬菌體載體、噬菌體載體 （bacterieophagebacterieophage vectorvector）基因組特點基因組特點：u50kb雙鏈雙鏈DNA分子，末端分子，末端12bp為互補單鏈為互補單鏈（cos位點，又稱粘端）位點，又稱粘端）u兩個啟動子：兩個啟動子：PR和和PLu編碼基因：包裝蛋白，裂解功能蛋白等編碼基因：包裝蛋白，裂解功能蛋白等生長方式生長方式：u溶菌性生長（組裝噬菌體）溶菌性生長（組裝噬菌體）u溶

48、源性生長（整合入細菌溶源性生長（整合入細菌DNA內）內）噬菌體載體（噬菌體載體（Bacteriophage Lambda）cosTACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCCCCGCCGCTGGAGCGCCos序列及酶切割位點序列及酶切割位點載體種類：載體種類：u插入載體插入載體（insertion vector）：）：外源性外源性DNA直直接插入酶切位點（接插入酶切位點（EcoR）容量：幾個容量：幾個kb代表載體：代表載體：gt10； gt11用途：構建用途：構建cDNA文庫文庫u替代載體替代載體（substitution vector）：）：外源性外源性DNA替代載體中央部分替代載體中

49、央部分酶切位點：酶切位點：EcoR；BamH；Sal容量：容量：9-22kb代表載體：代表載體：EMBL4用途：構建基因組文庫用途：構建基因組文庫coscoscoscoscoscoscIEcoR IEcoR IlacZE,B,SE,B,Sgt10gt11EMBL4 噬菌體插入載體和替代載體示意圖噬菌體插入載體和替代載體示意圖3 3、柯斯質粒載體、柯斯質粒載體（cosmid）基因組組成：基因組組成：質粒與噬菌體的質粒與噬菌體的cos位點聯(lián)合位點聯(lián)合構成、構成、 4-6kb、質粒復制起始位點、酶切位質粒復制起始位點、酶切位點、抗藥性基因；點、抗藥性基因；容量：容量：29-45kb代表載體：代表載體

50、： pGEM-3Zf（-）工作方式：工作方式：具有噬菌體樣的包裝和感染，具有噬菌體樣的包裝和感染，又具有質粒樣的復制又具有質粒樣的復制用途：用途：基因組文庫基因組文庫（三）目的基因（三）目的基因（target genetarget gene）1、目的基因的用途、目的基因的用途研究該基因的全貌與內涵：結構、功能、調研究該基因的全貌與內涵：結構、功能、調控控尋找異?；虍惓｜c，探索疾病的機理與治尋找異常基因異常點，探索疾病的機理與治療療研究生物種系進化與相關同源性研究生物種系進化與相關同源性基因工程重組表達基因工程重組表達改造某些基因，以改良品種改造某些基因，以改良品種基因治療基因治療2 2、獲得

51、目的基因的方法、獲得目的基因的方法原核目的基因獲得：原核目的基因獲得：直接分離直接分離真核目的基因獲得：真核目的基因獲得：l基因組文庫篩選基因組文庫篩選lcDNA文庫篩選文庫篩選l人工合成人工合成lPCR合成合成 DNA文庫概念文庫概念 DNA文庫（文庫（DNA library）：）：通過重組、克隆方法通過重組、克隆方法保存在宿主細胞中的各種重保存在宿主細胞中的各種重組組DNA分子的集合體分子的集合體 。 分兩類：分兩類：基因組文庫基因組文庫(genomic library)：將某種生物細胞的將某種生物細胞的基因組基因組DNA切割成一定大小的片段后，分別與合適切割成一定大小的片段后，分別與合適

52、的載體重組并導入宿主細胞內克隆保存。這種保存的載體重組并導入宿主細胞內克隆保存。這種保存在宿主細胞內的整個基因組在宿主細胞內的整個基因組DNA片段集合體稱片段集合體稱。cDNA文庫文庫(cDNA library)：將分離純化獲得某種真將分離純化獲得某種真核細胞中的全部核細胞中的全部mRNA逆轉錄成逆轉錄成cDNA，并通過重并通過重組、克隆方法保存在宿主細胞中。這種保存在宿主組、克隆方法保存在宿主細胞中。這種保存在宿主細胞內的細胞內的cDNA集合體稱集合體稱。用聚合酶鏈反應（用聚合酶鏈反應（PCR）方法獲取目的基方法獲取目的基因因第一次循環(huán)：第一次循環(huán)：變性（變性（95oC） 退火退火延伸（延伸

53、（72oC）第二次循環(huán)第二次循環(huán)第三次循環(huán)第三次循環(huán)2530次循環(huán)后次循環(huán)后模板模板DNA含量含量可以擴大可以擴大100萬萬百倍以上百倍以上用用聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（PCR）方法獲取目的基因方法獲取目的基因一對引物分別含有一對引物分別含有BamH I 和和Hind III 位點，位點，PCR產物經雙產物經雙酶切后，可定向插入載體。酶切后，可定向插入載體。（四）外源基因與載體的連接（四）外源基因與載體的連接作用酶：作用酶：DNA連接酶連接酶連接方式：連接方式：l粘性末端連接粘性末端連接l平末端平末端l同聚物加尾連接同聚物加尾連接l人工接頭人工接頭 人工接頭人工接頭連接連接法法BamHI接頭

54、接頭連接酶連接酶BamHI切割切割連接酶連接酶 + BamHI切割的切割的pBR322（五）重組（五）重組DNA導入受體菌導入受體菌1、重組子導入受體菌的方式、重組子導入受體菌的方式 ：u轉化（轉化（transformation）：）：特指將質粒特指將質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。菌的過程。u轉染（轉染（transfection）：）：病毒及其重組子病毒及其重組子導入受體細胞。導入受體細胞。2 2、導入方法、導入方法u氯化鈣法氯化鈣法 感受態(tài)感受態(tài) ：細菌處于容易吸收外細菌處于容易吸收外源源DNA的狀態(tài)稱的狀態(tài)稱感受態(tài)感受態(tài) 制備條件：制備條件

55、：冰浴、低滲冰浴、低滲CaCl2 （ 0.1mol/L ） 轉化反應：轉化反應：冰浴冰浴30分分短暫短暫熱休克（熱休克（42） 轉化效率轉化效率：105-106/g DNA;環(huán)狀環(huán)狀DNA高于高于線狀線狀DNA 1000倍倍u電穿孔法：電穿孔法：電穿孔儀電穿孔儀（六）重組子的篩選與鑒定（六）重組子的篩選與鑒定1、陽性菌落篩選：、陽性菌落篩選：u抗藥性標志：抗藥性標志：ampr、tetr、neoru插入抗性失活插入抗性失活u互補篩選：藍白斑篩選（互補篩選：藍白斑篩選（-互補）、營互補）、營養(yǎng)缺陷互補養(yǎng)缺陷互補u分子雜交：原位雜交、分子雜交：原位雜交、southern雜交雜交2 2、插入外源性、插

56、入外源性DNADNA的鑒定：的鑒定：u酶切（目的片段長度）酶切（目的片段長度）uPCRPCRu測序測序3 3、表達蛋白的鑒定：、表達蛋白的鑒定：免疫學、生物學免疫學、生物學活性活性抗藥性抗藥性篩選篩選多克隆位點多克隆位點啟動子啟動子裂開的裂開的N端端裂開的裂開的N端端外源外源DNA 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 N端編碼序列端編碼序列pUC182686bppUC182686bp染色體染色體重組體重組體pUC18細菌在含細菌在含X-gal和乳糖操和乳糖操縱子誘導劑的瓊脂上培養(yǎng)縱子誘導劑的瓊脂上培養(yǎng)細菌在含細菌在含X-gal和乳糖操縱和乳糖操縱子誘導劑的瓊脂上培養(yǎng)子誘導劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC18含重組體含重

57、組體pUC18的白色菌落的白色菌落藍色菌落藍色菌落含載體含載體pUC18的藍色菌落的藍色菌落 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C 端編碼序列端編碼序列轉化轉化轉化轉化 利用利用 互補原理篩選（蘭白斑篩選）重組子互補原理篩選（蘭白斑篩選）重組子pUC18amprampr藍白斑篩選重組質粒藍白斑篩選重組質粒原位雜交原位雜交Radioactive probe will hybridize with its complementary DNAWash filter, prepare autoradiograph and compare with master platePlace nitrocellulose f

58、ilter in sealable plastic bag with solution of labeled DNA probeSouthern blot免疫學方法篩選重組子免疫學方法篩選重組子DNA DNA 重組技術實例：重組技術實例： 基因文庫構建與篩基因文庫構建與篩選選 人基因組文庫構建人基因組文庫構建Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector. 人基因組人基因組DNA用限制性內切用限制性內切酶（酶（Sau 3A）部分消化產生部分消化產生約約20-kb帶粘性末端的部分重帶粘性末端的部

59、分重疊的隨機片段；疊的隨機片段；載體消化：載體消化： 噬菌體噬菌體DNA用用Bam H1消化，去掉中間的可消化，去掉中間的可置換片段，并產生左右兩個置換片段，并產生左右兩個帶粘性末端的片段帶粘性末端的片段基因組片段與基因組片段與 噬菌體噬菌體DNA拼拼接成重組接成重組DNA體外裝配有活性的噬菌體，體外裝配有活性的噬菌體，并感染大腸桿菌并感染大腸桿菌菌種培養(yǎng)、篩選、擴增保存菌種培養(yǎng)、篩選、擴增保存Infect E.coliIndividual clonesProduction of overlapping restriction fragments by partial digestion of

60、 human genomic DNA with Sau3A. This restriction endonuclease recognizes the 4-bp sequence GATC and produces fragments with single-stranded sticky ends with this sequence on the 5 end of each strand. A hypothetical region of human genomic DNA showing the Sau3A recognition sites (red) is shown at the top.