實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的制備(共22頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)課指導(dǎo)（修訂版）草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護(hù)研究所編寫(xiě)2012.09.01實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的制備一實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_培養(yǎng)基的配置原理。通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配置，掌握配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二實(shí)驗(yàn)原理馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是一種半合成培養(yǎng)基，適宜于培養(yǎng)各種類(lèi)型微生物，尤其適合培養(yǎng)真菌。這種培養(yǎng)基是由天然材料馬鈴薯和葡萄糖組成的，營(yíng)養(yǎng)豐富而且原料容易取得，是一種使用而價(jià)廉的培養(yǎng)基。馬鈴薯浸出粉有助于各種微生物的生長(zhǎng)，葡萄糖提供能源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。牛肉浸膏培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌培養(yǎng)基，有時(shí)又稱(chēng)普通培養(yǎng)基，由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)所需的最基本

2、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微生物生長(zhǎng)繁殖之用?；A(chǔ)培養(yǎng)基中含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中，牛肉膏作為微生物碳源，能源，磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，而NaCl提供無(wú)機(jī)鹽。在配置牛肉浸膏培養(yǎng)基時(shí)還需要加入一定量的瓊脂作為凝固劑。高氏一號(hào)是用來(lái)培養(yǎng)和觀察形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。如果加入適量的抗菌藥物，則可用來(lái)分離各種放線菌。此合成培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有多種化學(xué)成分已 知的，這些無(wú)機(jī)鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。因此，混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時(shí)還需要將兩種或多種成分分別滅菌，使用時(shí)再按比例混合。三實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料：牛肉浸膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、NaOH溶液、H

3、Cl(酸液)、葡萄糖、馬鈴薯(土豆)、酒精、可溶性淀粉2 g、KNO3 0.1 g、K2HPO4 0.05g，MgSO4· 7H2O 0.05 g、NaCl 0.05 g、FeSO4· 7H2O 0.001 g (母液)、2 g、自來(lái)水100mL等。實(shí)驗(yàn)器材：高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電爐、天平、三角瓶、紗布、線繩、記號(hào)筆、超凈工作臺(tái)、pH計(jì)、玻璃棒、量筒，燒杯和三角瓶等。四實(shí)驗(yàn)步驟(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的簡(jiǎn)稱(chēng)，即Potato Dextrose Agar 。1、 配方：馬鈴薯(去皮)200 g、蔗糖15-20 g、瓊脂20-30 g、蒸餾水1

4、000 mL。PH自然。2、 步驟：(1) 將馬鈴薯洗凈，去皮，切成大小約為1-3 cm的小塊，稱(chēng)200 g，放入1000 mL水中煮沸20-30 min，用四層紗布過(guò)濾，取其濾液；    (2)定容：加水補(bǔ)足至1000 mL；    (3)加入稱(chēng)量好的蔗糖和瓊脂至全部溶化；    (4)趁熱分裝至試管或三角瓶；    (5)用封口膜封口，扎緊，即可進(jìn)行滅菌；(6)滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后將培養(yǎng)基取出；(7)一般在培養(yǎng)基溫度降

5、至50-60攝氏度的時(shí)候開(kāi)始在超凈工作臺(tái)上往培養(yǎng)皿中分裝；(8)待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿倒置，防止皿蓋上的冷凝水污染培養(yǎng)基(此時(shí)皿蓋在下，培養(yǎng)基中蒸發(fā)出的水蒸氣是向上走的，還是凝結(jié)于培養(yǎng)基上，就不會(huì)有在皿蓋上形成水滴后再滴落的情況了，如此可防止污染)。 (2) 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基    1、配方：牛肉膏3-5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20-30 g、蒸餾水1000 mL。PH值7.4-7.6。    2、步驟：    (1)稱(chēng)量：根據(jù)用量按比例依次稱(chēng)取各種成分，牛肉膏

6、常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水融化后到入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱(chēng)量時(shí)要迅速。    (2)溶解：在燒杯中加入少于所需的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過(guò)程需不斷攪拌。加熱時(shí)應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，補(bǔ)足所需水分。    (3)調(diào)pH值：若pH值不適宜，可用1 mol/L NaOH或1 mol/LHCl把pH值調(diào)至所需范圍。    (4)過(guò)濾：趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利于某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，如無(wú)特殊要求時(shí)可省去此步驟。  

7、;  (5)分裝：按照實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)；分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的1/2為宜。    以下步驟同上(5)-(8)(3)高氏培養(yǎng)基：高氏培養(yǎng)基是用來(lái)培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。1.配方可溶性淀粉(20 g)、KNO3(1 g)、K2HPO4(0.5 g)、MgSO4· 7H2O(0.5 g)、NaCl(0.5 g)、FeSO4· 7H2O(0.01 g)、瓊脂 20 g、pH=7.4-7.6。2、步驟：配制時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)

8、成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分到100 mL，調(diào)pH，121滅菌20 min。高溫滅菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100 mL培養(yǎng)皿中混勻，將培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)約15 mL/皿。實(shí)驗(yàn)二 環(huán)境中微生物的分離和培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;1、消毒和滅菌的操作方法及原理。2、證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物。3、學(xué)習(xí)空氣、土壤、實(shí)驗(yàn)室中微生物分離的方法。4、觀察不同類(lèi)群微生物的菌落形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)原理 微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必須從中進(jìn)行分離。在保藏菌種時(shí)不慎污染時(shí)也需予以分離。 分離純化方法很多，基本原

9、理相似，即將待分離樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)刮⑸锏募?xì)胞(或孢子)盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長(zhǎng)成一個(gè)個(gè)純種單菌落。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類(lèi)都是極其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多有價(jià)值的菌株。三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料：PDA培養(yǎng)基(上一次實(shí)驗(yàn)課已準(zhǔn)備) 實(shí)驗(yàn)器材：天平、酒精燈、培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)箱、記號(hào)筆、無(wú)菌水、超凈工作臺(tái)、棉花、酒精、撥針、接種環(huán)、手術(shù)刀和鑷子等。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)消毒和滅菌(1)無(wú)菌濾紙的干熱滅菌(暫時(shí)不做該部分) 在160下，烘2小時(shí)。 開(kāi)始滅菌時(shí)升溫不宜過(guò)猛，物品

10、不要太擠，溫度上升至160時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，2小時(shí)后切斷電源，溫度降至60 左右后，取出滅菌物品。(2)接種針、鑷子等的高溫火焰滅菌 在95%酒精中浸過(guò)后，通過(guò)火焰將酒精燒去，重復(fù)三次以上。(3)紫外線用于空氣消毒 波長(zhǎng)在250-280 nm的紫外線殺菌力最強(qiáng)，30瓦紫外光燈直射2 m內(nèi)照射半小時(shí)，即可殺死空氣中的微生物。打開(kāi)紫外燈，滅菌30 min。(4)化學(xué)藥品用于種子及植物表面消毒次氯酸鈉消毒：種子用1%，植物器官用0.3%消毒各1 min。再用無(wú)菌水漂洗3-5次。(二)環(huán)境中微生物的檢測(cè)1. 器材 PDA培養(yǎng)基(上一次實(shí)驗(yàn)課已備)，無(wú)菌鑷子，無(wú)菌棉球等2. 實(shí)驗(yàn)步驟：(1) 取5個(gè)倒好培養(yǎng)基

11、的培養(yǎng)皿作為對(duì)照;(2) 取3個(gè)PDA培養(yǎng)基，打開(kāi)皿蓋，使培養(yǎng)基暴露在空氣中約10 min，再蓋上皿蓋，寫(xiě)明處理、組別和日期；(3) 取3個(gè)PDA培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子夾上無(wú)菌棉球在實(shí)驗(yàn)臺(tái)或凳子上擦以下，然后打開(kāi)皿蓋用棉球在培養(yǎng)基表面輕輕涂抹(勿劃破培養(yǎng)基)，寫(xiě)明處理、組別和日期再蓋上皿蓋；(4) 取3個(gè)PDA培養(yǎng)基，打開(kāi)皿蓋用你的手指在培養(yǎng)基表面接觸輕壓3-5點(diǎn)，再蓋上皿蓋。寫(xiě)明處理、組別和日期；(5) 取取3個(gè)PDA培養(yǎng)基，打開(kāi)皿蓋，對(duì)著培養(yǎng)基表面咳嗽或打噴嚏2-3次(或者深呼吸)，再蓋上皿蓋。寫(xiě)明處理、組別和日期；(6) 上述工作完備后，將各皿倒置保存在28下，培養(yǎng)3-6天。3天后進(jìn)行初次

12、統(tǒng)計(jì)，7天后，進(jìn)行再次統(tǒng)計(jì)。五、思考題1. 反復(fù)練習(xí)消毒和滅菌，并搞清楚其本質(zhì)的區(qū)別。2. 統(tǒng)計(jì)結(jié)果并做表，完成以下表格的內(nèi)容環(huán)境/人體菌落數(shù)(個(gè)/皿)菌落特征(形狀、顏色、大小、隆起度、邊緣等)實(shí)驗(yàn)三 病原微生物的分離和培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;1、熟練掌握無(wú)菌操作技術(shù)和消毒、滅菌的操作步驟及其原理2、掌握植物病原真菌的分離、培養(yǎng)和接種的一般方法，并掌握其基本原理二、實(shí)驗(yàn)原理 自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)，即為微生物的分離與純化。植物病原微生物的分離培養(yǎng)對(duì)病原物鑒定、病

13、原物形態(tài)觀察、植物病害接種體的培養(yǎng)等方面都是經(jīng)常使用的研究手段。 植物患病組織內(nèi)的微生物，如果給予適宜的環(huán)境條件，除個(gè)別種類(lèi)外，一般都能恢復(fù)生長(zhǎng)和繁殖。植物病原微生物的分離就是指通過(guò)人工培養(yǎng)，從染病植物組織中將病原真微生物與其它微生物相分開(kāi)，并從寄主植物中分離出來(lái)，再將分離到的病原微生物于適宜環(huán)境內(nèi)純化，這個(gè)過(guò)程總稱(chēng)植物病微生物的分離培養(yǎng)。植物病原真微生物的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經(jīng)表面消毒和滅菌水洗過(guò)后，移到人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料：植物病株(校園中紅豆草褐稈病)、種子(苜蓿、紅豆草、沙打旺)、土樣(校園紅豆草地中)，培養(yǎng)基(馬鈴薯

14、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA供分離真菌，牛肉胨培養(yǎng)基NA供分離細(xì)菌)。實(shí)驗(yàn)工具：無(wú)菌培養(yǎng)皿、三角瓶、玻璃刮刀、吸管、手術(shù)刀、鑷子、酒精燈、無(wú)菌濾紙、酒精燈，剪刀，小燒杯，大燒杯和記號(hào)筆等。實(shí)驗(yàn)試劑：無(wú)菌水，75%酒精、0.1%NaClO溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 準(zhǔn)備工作1. 工作環(huán)境的清潔和消毒 在無(wú)菌室、無(wú)菌箱或無(wú)菌工作臺(tái)(超凈工作臺(tái))上進(jìn)行。 超凈工作臺(tái)要經(jīng)過(guò)紫外線照射(30 min)并用藥物消毒(70%酒精噴霧)。2. 分離材料的選擇 選擇新近發(fā)病的植株、器官或組織作為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植株壞死部分的內(nèi)部或表面，都可能有腐生物的寄生，所以一般斑點(diǎn)病要從病斑邊緣的組織剪取，即從

15、病、健組織交界處獲得分離材料，將感病組織洗凈后放入試管或培養(yǎng)皿內(nèi)。圖1：新鮮植物病株示意圖(二)植物病原真菌的分離 1. PDA培養(yǎng)基的制備 2. 沖洗病葉，從病斑周?chē)?-2 mm處剪取。 3. 取滅菌的小燒杯或培養(yǎng)皿，放入組織材料，先用70%酒精溶液處理30-60秒，再用0.3%次氯酸鈉溶液處理1-3分鐘。4. 消毒后，取出，用無(wú)菌水沖洗3-5次。 5. 用滅菌鑷、剪在無(wú)菌條件下將分離材料剪成2-3 mm大小的方塊，每塊組織均為病健相間的組織。用滅菌鑷子夾取剪好的材料，加入培養(yǎng)基平板上輕輕按壓，每皿4-5塊，排放均勻。 6. 用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿上注明分離的代號(hào)、日期、姓名，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)置于22

16、-25的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 7. 3-4天后，挑選由分離材料上長(zhǎng)出的典型而無(wú)雜菌的菌落，在菌落邊緣用菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊轉(zhuǎn)入斜面試管培養(yǎng)基中央，或有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，于25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。圖2：病原真菌在培養(yǎng)皿中的分離培養(yǎng)情況(3) 土壤細(xì)菌的分離1. 制作土壤稀釋液：準(zhǔn)確稱(chēng)取土樣10 g，加入裝有90 mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20 min，使土樣與水充分混勻。用一支無(wú)菌吸管從中吸取1 mL土壤懸液加入裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液；再換一支無(wú)菌吸管吸取10-2稀釋液1 mL，移入裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，也吹吸三次，

17、即成l0-3稀釋液；以此類(lèi)推，連續(xù)稀釋?zhuān)瞥?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列土壤稀釋液。2. 涂布：將無(wú)菌平板編上10-4、10-5、10-6號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)置至少三個(gè)重復(fù)，用無(wú)菌移液管按無(wú)菌操作要求吸取10-6稀釋液各1 mL放入編號(hào)10-6的3個(gè)平板中，同法吸取10-5稀釋液各l mL放入編號(hào)10-5的3個(gè)平板中，再吸取10-4稀釋液各l mL放入編號(hào)10-4的3個(gè)平板中(由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換)。再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌玻璃涂棒，更換稀釋度時(shí)需將玻璃涂棒灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換涂棒

18、。 3. 培養(yǎng)：至于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 圖3.：制備土壤稀釋液(分級(jí)稀釋)圖4：平板劃線法分離平板劃線法分離的方法1. 斜線法 2. 曲線法 3.方格法 4. 放射法 5. 四格法圖5：劃線法得到的培養(yǎng)物3. 培養(yǎng)(28)4. 分離菌種統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每種菌在土壤中的數(shù)量(多少菌落/克土壤)5. 菌種純化(24 h后)6. 菌種保藏(留作鑒定)(四)菌種的純化1. 菌落邊緣切取法：選擇典型菌落，用滅菌的接種環(huán)切取邊緣菌絲或孢子移植到斜面或平板上培養(yǎng)，可以獲得純培養(yǎng)菌種。2. PDA平板表面單孢子挑取法：將需要純化的菌種在無(wú)菌玻片上水滴中懸浮開(kāi)，再用接種環(huán)劃線到平板上，繼而在顯微鏡下挑選單孢子移植培養(yǎng)

19、。圖6：真菌孢子示意圖五、思考題1. 試擬出從土壤中分離芽孢桿菌的主要實(shí)驗(yàn)步驟。2. 如何檢驗(yàn)平板上某個(gè)單菌落是不是純培養(yǎng)？實(shí)驗(yàn)四 微生物的純化、菌落計(jì)數(shù)及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;1、學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。2、初步掌握微生物純化的基本方法。3、學(xué)習(xí)并掌握微生物的形態(tài)學(xué)鑒定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說(shuō)一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測(cè)樣品作一系列稀釋?zhuān)偃∫欢康南♂尵航臃N到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品

20、中的含菌數(shù)。自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類(lèi)微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱(chēng)為微生物的分離與純化。微生物的分類(lèi)鑒定是微生物的重要內(nèi)容，一般從菌落特征、細(xì)菌特點(diǎn)及生理生化、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)特征始終被用作微生物分類(lèi)和鑒定的重要依據(jù)之一，其中有兩個(gè)重要原因：一是它易于觀察和比較，尤其是在真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌中；二是許多形態(tài)學(xué)特征依賴(lài)于多基因的表達(dá)，具有相對(duì)的穩(wěn)定性。 不同種類(lèi)微生物應(yīng)采用不同的重點(diǎn)鑒定指標(biāo)：真菌：形態(tài)特征較豐富、細(xì)胞體積較大，以

21、形態(tài)特征為主要指標(biāo)；放線菌、酵母菌：形態(tài)特征與生理特征兼用；細(xì)菌：形態(tài)特征較缺乏，使用較多的生理、生化和遺傳等指標(biāo)。1. 培養(yǎng)特征： 菌落特征，大小、側(cè)面隆起、光澤、粘稠、顏色、邊緣、表面狀況、質(zhì)地、水溶性色素(粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)紅色或紫紅色色素)等2. 細(xì)胞形態(tài)：形態(tài)：球形、桿狀、弧形、螺旋形、絲狀、分枝及特殊形狀大?。浩渲凶钪匾氖羌?xì)胞的寬度或直徑 排列：?jiǎn)蝹€(gè)、成對(duì)、成鏈或其他特殊排列方式 3. 特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)有無(wú)鞭毛、芽孢、莢膜(糖被)、菌膠團(tuán)孢子：形狀、大小、顏色、著生位置、數(shù)量及排列 細(xì)胞附屬物：如柄、絲狀物、鞘、異形胞等超微結(jié)構(gòu)：壁、內(nèi)膜系統(tǒng)、放線菌孢子表面特征等三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料：上

22、節(jié)實(shí)驗(yàn)課分離的微生物；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基；加有氯霉素(或慶大霉素)和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基:在1000 mL培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2 mL，孟加拉紅33.4 mg，均于滅菌前加入。實(shí)驗(yàn)工具：記號(hào)筆、酒精燈、打火機(jī)、接種環(huán)、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、撥針、濾紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 選取每皿菌落數(shù)在10100之間的平板用于計(jì)數(shù)。不應(yīng)遺漏酵母菌的菌落，必要時(shí)可制片檢查，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中從土壤中分離出的的菌落數(shù)目(二)挑菌純化從長(zhǎng)有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落(包括酵母菌菌落)轉(zhuǎn)接斜面，并同時(shí)制片作純度檢查。若不純，應(yīng)進(jìn)一步挑取該菌落采用劃線分離，或制成菌懸液進(jìn)一步作稀

23、釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體為止。（三） 鑒定：1. 搽拭干凈載玻片和蓋玻片2. 載玻片上加一滴水，挑少許真菌的菌絲和孢子放到水滴中，蓋玻片一側(cè)先接觸水滴附近，另一側(cè)輕輕放下，使水滴均勻分布在蓋玻片和載玻片之間，且無(wú)氣泡3. 放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，選擇單個(gè)的菌絲、孢子和分生孢子梗4. 放到高倍鏡下觀察和繪圖思考題1. 統(tǒng)計(jì)土壤中分離出的細(xì)菌種類(lèi)，描述各種菌落特征、菌體形態(tài)和生化反應(yīng)結(jié)果，并計(jì)算在土壤中的數(shù)量。2. 統(tǒng)計(jì)植物組織中和種子上分離出的真菌種類(lèi)，描述每種菌的菌落特征、孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)(繪圖)，統(tǒng)計(jì)分離率或種子帶菌率。實(shí)驗(yàn)五 微生物的計(jì)數(shù)和測(cè)量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解目鏡測(cè)微計(jì)和鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)

24、的構(gòu)造。2、掌握用顯微測(cè)微計(jì)測(cè)量微生物細(xì)胞大小的方法。3、了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、原理和使用方法。4、 掌握應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定青霉菌孢子濃度的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理在一定條件下，各種微生物細(xì)胞的大小，是微生物形態(tài)特征之一，也是分類(lèi)鑒定的依據(jù)之一。由于微生物細(xì)胞很小，只能在顯微鏡下測(cè)量，一般采用顯微測(cè)微計(jì)來(lái)測(cè)量。顯微測(cè)微計(jì)有鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)和接目測(cè)微計(jì)兩個(gè)部件。鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)是在中央部分刻有精度等分線的載玻片。一般將1 mm等分為100格，每格長(zhǎng)度為10 mm，用于校正接目測(cè)微計(jì)。接目測(cè)微計(jì)可直接用于測(cè)量細(xì)胞的大小。它是一塊可放在目鏡內(nèi)的圓形玻片，其中央一般有100等分的小格，每小格代表的長(zhǎng)度隨目鏡、物鏡放大倍

25、數(shù)的大小而改變。通常必須以鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)來(lái)校準(zhǔn)，從而計(jì)算出在一定的接物鏡和接目鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，接目測(cè)微計(jì)每格的實(shí)際代表長(zhǎng)度，最后方可利用接目測(cè)微計(jì)直接測(cè)量被測(cè)對(duì)象的長(zhǎng)度和寬度。目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定 把目鏡的上透鏡旋開(kāi)，將目鏡測(cè)微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線。根據(jù)下列標(biāo)定公式進(jìn)行標(biāo)定。 接目測(cè)微計(jì)每格的長(zhǎng)度(mm)例如，目鏡測(cè)微尺20個(gè)小格等于鏡臺(tái)測(cè)微尺3小格，已知

26、鏡臺(tái)測(cè)微尺每格為10 mm，則3小格的長(zhǎng)度為3×10=30mm，那么相應(yīng)地在目鏡測(cè)微尺上每小格長(zhǎng)度為3×10÷20=1.5 mm。用以上計(jì)算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際長(zhǎng)度。顯微直接計(jì)數(shù)法，即利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成1

27、6個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為l mm，則每一個(gè)大方格的面積為l mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.l mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬(wàn)分之一毫升)。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1 mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B(個(gè)

28、)同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1 mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B(個(gè))三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料：菌種 青霉菌(Saccharomyces cerevisiae)斜面培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)工具：普通光學(xué)顯微鏡、鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)、接目測(cè)微計(jì)、蓋玻片、載玻片、香柏油、滴管、血球計(jì)數(shù)板、擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)菌體大小的測(cè)定1、放置目鏡測(cè)微計(jì)取出接目鏡，旋開(kāi)接目透鏡，將接目測(cè)微計(jì)放在目鏡的隔板上(有刻度的一面向下)，然后旋上接目鏡，最后將此接目鏡插入目鏡鏡筒內(nèi)。2、放置鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)把鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)放在顯微鏡載物臺(tái)上(有刻度的一面向上)。3、校正接目測(cè)

29、微計(jì)用低倍物鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，通過(guò)調(diào)焦能看清鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)的刻度；移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)和轉(zhuǎn)動(dòng)接目測(cè)微計(jì)使兩者刻度平行；轉(zhuǎn)動(dòng)推進(jìn)器從而使兩測(cè)微計(jì)某段起、止線完全重合，數(shù)出兩條重合線之間的格數(shù)。用同法分別校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。4、計(jì)算接目測(cè)微計(jì)每格的相對(duì)長(zhǎng)度接目測(cè)微計(jì)每格的長(zhǎng)度(mm)5、將鏡臺(tái)測(cè)微尺取下，分別換上青霉菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。先量出菌體的長(zhǎng)和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度計(jì)算出菌體的長(zhǎng)和寬。并詳細(xì)記錄于表1中。例如，目鏡測(cè)微尺在這架顯微鏡下，每格相當(dāng)于1.5 m，測(cè)量的結(jié)果，若菌體的平均長(zhǎng)

30、度相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的2格，則菌體長(zhǎng)應(yīng)為3×1.5 m=3.0 m。一般測(cè)量菌體的大小，應(yīng)測(cè)定10-20個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。(二)微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1、青霉菌孢子懸液的制備(1)取一支孢子成熟的青霉菌斜面培養(yǎng)物，用無(wú)菌移液管吸取5ml無(wú)菌水加入菌管中。(2)采用無(wú)菌操作技術(shù)，用接種環(huán)將菌管內(nèi)斜面上的孢子輕輕刮下，注入到盛有玻璃珠的三角瓶中，同樣方法將另15 mL無(wú)菌水分三次再加入菌管中，將剩余的孢子全部刮干凈，將孢子液全部合并于三角瓶中，水平旋轉(zhuǎn)振蕩30 min，然后倒入含有脫脂棉的無(wú)菌漏斗中過(guò)濾，得單孢子懸浮液。2、顯微鏡下孢子濃度測(cè)定(1)稀釋定量取出孢子懸

31、液，加到無(wú)菌干燥的試管中，按照一定倍數(shù)將其稀釋?zhuān)♂尩某潭纫话阋匝蛴?jì)數(shù)板每小格內(nèi)含有510個(gè)菌或孢子最為合適。(2)加樣取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，用無(wú)菌滴管從蓋玻片的邊緣滴一滴孢子稀釋液，則孢子稀釋液自行滲入，注意不要產(chǎn)生氣泡。(3)計(jì)數(shù)靜置5 min，使孢子沉降不再流動(dòng)，然后即可在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室的位置，然后換成高倍鏡計(jì)數(shù)。如發(fā)現(xiàn)孢子懸液太濃或太稀釋?zhuān)瑧?yīng)重新稀釋并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中的計(jì)算結(jié)果取平均值，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，并詳細(xì)記錄于表2中。(4)清洗血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板取下，在水龍頭上用水柱沖洗，切忌用硬物洗刷，然后自然吹干，鏡檢觀察

32、是否有孢子或其他沉積物，直至洗刷干凈。五、思考題1目鏡測(cè)微尺標(biāo)定結(jié)果：低倍鏡下 倍目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度是 m。高倍鏡下 倍目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度是 m。油鏡下 倍目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度是 m。2 菌體大小測(cè)定結(jié)果(表1)：菌號(hào)目微尺每格代表長(zhǎng)度寬長(zhǎng)菌體大小范圍目微尺格數(shù)寬度目微尺格數(shù)長(zhǎng)度3菌體數(shù)目測(cè)定結(jié)果(表2)A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。 各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室         第二室      

33、0;  實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌的革蘭氏染色及其形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中的重要性。2、學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色技術(shù)，進(jìn)一步熟練光學(xué)顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類(lèi)和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法(Gram stain)不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類(lèi)：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱(chēng)為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色(復(fù)染顏色)的稱(chēng)為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形

34、成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過(guò)程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類(lèi)物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類(lèi)物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液(番紅)的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料(basic dye)初染液；媒染劑(mordant)；脫色劑(decolorising agent)和復(fù)染液(counterstain)。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(crysta