紫外可見分光光度計(jì)

1、第二章、紫外第二章、紫外-可見分光光度法可見分光光度法 本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容1、紫外-可見吸收光譜2、紫外-可見光度計(jì)儀器組成3、吸收光譜的測量- Lambert-Beer 定律4、分析條件選擇5、UV-Vis分光光度法的應(yīng)用 第一節(jié)、紫外第一節(jié)、紫外-可見吸收光譜可見吸收光譜UV-Vis方法是分子光譜方法，它利用分子對外來輻射的選擇性吸收特性。UV-Vis涉及分子外層電子的能級躍遷；光譜區(qū)在160780nm。紫外可見分子吸收光譜測定所用的儀器是紫外可見分光光度計(jì)，其測定波長范圍為200 1000nm。UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光譜(UV)為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，

2、尤其是有機(jī)化合物的重要定性工具之一。 第二節(jié)、光譜儀器第二節(jié)、光譜儀器 組成：組成： 1.光源； 2.單色器； 3.樣品容器； 4.檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）； 5.信號顯示器（ 電子讀出、數(shù)據(jù)處理及記錄） 1、光源、光源 是一種有光譜特性的器件，理想的光源必須滿足：在使用波長范圍內(nèi)有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性；輻射光是連續(xù)的，其強(qiáng)度不隨波長的變化而發(fā)生明顯的變化。常用的紫外光源是氫燈或氘燈，波長范圍為160-375nm，同樣條件下氘燈的輻射強(qiáng)度比氫燈大4倍左右。常用的可見光源為鎢燈或碘鎢燈，使用的波長范圍為3501000nm。近年來，碘鎢燈因壽命長、強(qiáng)度大而代替了鎢燈。2、分光系統(tǒng)、分光系統(tǒng)(單

3、色器單色器) 將由不同波長的“復(fù)合光”分開為一系列“單一”波長的“單色光”的器件。 理想的100%的單色光是不可能達(dá)到的，實(shí)際上只能獲得的是具有一定“純度”的單色光，即該“單色光具有一定的寬度（有效帶寬）。 有效帶寬越小，分析的靈敏度越高、選擇性越好、分析物濃度與光學(xué)響應(yīng)信號的線性相關(guān)性也越好。構(gòu)成：狹縫、準(zhǔn)直鏡、棱鏡或光柵、會聚透鏡常用的色散元件有棱鏡和光柵。商品儀器多選用光柵，因光柵可在整個(gè)波長區(qū)提供良好的均勻一致的分辨能力，而且成本低，便于保存。 入射狹縫入射狹縫準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直鏡物鏡物鏡棱鏡棱鏡焦面焦面出射狹縫出射狹縫f入射狹縫入射狹縫準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直鏡光柵光柵物鏡物鏡出射狹縫出射狹縫f其中最主要

4、的分光原件為棱鏡和光柵。其中最主要的分光原件為棱鏡和光柵。 3、吸收池、吸收池 除發(fā)射光譜外，其它光譜分析都需要吸收池。盛放 試樣的吸收池由光透明材料制成。 石英或熔融石英：紫外光區(qū)可見光區(qū)3m； 玻璃：可見光區(qū)（350-1000nm）； 透明塑料：可見光區(qū)（350-1000nm）； 鹽窗（NaCl晶體）：紅外光區(qū)。4、光電轉(zhuǎn)換器、光電轉(zhuǎn)換器（1）光電轉(zhuǎn)換器是將光輻射轉(zhuǎn)化為可以測量的電信號的器件。（2）理想的光電轉(zhuǎn)換器要求： 靈敏度高；S/N大；暗電流?。?響應(yīng)快且在寬的波段內(nèi)響應(yīng)恒定。早期檢測器早期檢測器 人眼人眼(Vis)，相板及照像膠片相板及照像膠片(UV-Vis) UV-Vis 硒光電

5、池硒光電池（Photovoltaic cell, ,光伏管光伏管） 350-(500)max-750nm 真空光電管真空光電管（Vacuum phototube） 據(jù)光敏材料而定據(jù)光敏材料而定 光電倍增管光電倍增管（Photomultiplier tube） ibid 光電轉(zhuǎn)換器光電轉(zhuǎn)換器(photo transducer) 硅二極管硅二極管（Silicon diode） 190-1100nm UVUV- -V Vis 5、信號顯示器、信號顯示器 由檢測器進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換后，信號經(jīng)適當(dāng)放大，用記錄儀進(jìn)行記錄或數(shù)字顯示。目前國產(chǎn)許多紫外可見分光光度計(jì)的儀器都配置有工作站和激光打印機(jī)，測定信號的記錄、

6、處理、打印操作都可以通過工作站的計(jì)算機(jī)進(jìn)行控制，工作較方便。第三節(jié)、紫外第三節(jié)、紫外可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)儀器的類型：按光學(xué)系統(tǒng)分為單波長和雙波長1. 單波長分光光度計(jì) 單光束 雙光束（空間分隔） 雙光束（時(shí)間分隔）特點(diǎn)：雙光束方法因光束幾乎同時(shí)通過樣品池和參比池， 因此可消除光源不穩(wěn)產(chǎn)生的誤差。 2. 雙波長分光度計(jì) 特點(diǎn)：可測多組份試樣、混濁試樣、而且可作成導(dǎo)數(shù) 光譜、不需參比液、克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈 敏度高。1單波長單光束分光光度計(jì)單波長單光束分光光度計(jì) 單光束分光光度計(jì)只有一條光路，通過變換參比池 和樣品池的位置，使它們分別進(jìn)入光路進(jìn)行測定。 首先用參比溶液調(diào)透光率10

7、0，然后對樣品溶液測 量并讀數(shù)。使用單光束分光光度計(jì)時(shí)，每換一次波長，要 用參比溶液校正透光率到100，才能對樣品進(jìn)行測定。 若要做紫外可見全譜區(qū)分析，則很麻煩，并且光源 強(qiáng)度不穩(wěn)定會引入誤差，此時(shí)可改用雙光束分光光度計(jì)。2單波長雙光束分光光度計(jì)單波長雙光束分光光度計(jì) 與單光束相似，不同的是在單色器與吸收池之間加了一個(gè)斬光器。把均勻的單色光變成頻率、強(qiáng)度相同的交替光，一束通過參比溶液，另一束通過樣品溶液，然后由檢測器交替接收參比信號和樣品信號，并把它們的差值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，?jīng)放大后由顯示系統(tǒng)顯示出來。 雙光束分光光度計(jì)適用于在寬的光譜區(qū)域內(nèi)掃描復(fù)雜的吸收光譜圖，但對生物樣品等復(fù)雜的試樣不易找到合

8、適的參比溶液。3雙波長分光光度計(jì)雙波長分光光度計(jì) 用兩種不同的波長的單色光1、2交替照射試液，并被光電倍增管交替接收，測得的是扣除了背景干擾的吸光度之差的A0。 雙波長測定法不用參比溶液，只用樣品溶液即可完全扣除背景(包括溶液的渾濁、吸收池的誤差)，大大提高了測定的準(zhǔn)確度。 第四節(jié)、紫外第四節(jié)、紫外可見吸收光譜法的定量分析可見吸收光譜法的定量分析1 .Lambert-Beer 定律定律 當(dāng)強(qiáng)度為I0的入射光束,通過裝有均勻待測物的介質(zhì)時(shí)，該光束將被部分吸收，未被吸收的光將透過待測物溶液。 當(dāng)入射光波長一定時(shí)，待測溶液的吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即。為摩爾吸光系數(shù)bcA2、朗伯、朗伯比爾

9、定律比爾定律 為摩爾吸光系數(shù)，僅與入射光的波長、被測組分的性質(zhì)和溫度有關(guān)，在一定條件下是被測物質(zhì)的特征性常數(shù)。 值越大，吸光程度越大，定量測定時(shí)的靈敏度越高； 1.0 x104時(shí)為強(qiáng)吸收， =1.0 x1034為較強(qiáng)吸收， 1.0 x102為弱吸收；b為液層厚度，cm； c為被測組分的濃度。 說明：在一定條件下溶液的吸光度A與被測物質(zhì)的濃度和液層厚度的乘積成正比。但必須滿足入射光是單色光、被照射物質(zhì)是均勻的非散射性物質(zhì)等條件。bcA3、 紫外紫外可見吸收光譜法的定量分析可見吸收光譜法的定量分析（1） 單組份定量方法 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2）標(biāo)準(zhǔn)對比法：是標(biāo)準(zhǔn)曲線法的簡化，即只配制一個(gè) 濃度為標(biāo)準(zhǔn)溶

10、液，并測量其吸光度，求出吸收系數(shù)k， 然后由Ax=kcx求出cx（2）多組分定量方法 吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測定多個(gè) 組份。 （3）雙波長法： 當(dāng)混合物的吸收曲線重迭時(shí)，可利用雙波長法來測定。第五節(jié)、紫外第五節(jié)、紫外可見吸收光譜分析實(shí)驗(yàn)技術(shù)可見吸收光譜分析實(shí)驗(yàn)技術(shù) 當(dāng)光度計(jì)使用一段時(shí)間后其波長和吸光度將出現(xiàn)漂移， 因此需要對其進(jìn)行校正。 波長標(biāo)度校正： 使用鐠-釹玻璃（可見光區(qū)）和鈥玻璃（紫外光區(qū)）進(jìn)行校正。因?yàn)槎呔衅涓髯缘奶卣魑辗濉?吸光度標(biāo)度校正： 采用 K2CrO4 標(biāo)準(zhǔn)液校正（在25C時(shí)，于不同波長處測定0.04000g/L的 KOH 溶液（0.05mol/L）的

11、吸光度 A，調(diào)整光度計(jì)使其A 達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)吸光度。1 儀器測量條件儀器測量條件 由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準(zhǔn)等常帶來誤差。當(dāng)分析高濃度的樣品時(shí)，誤差更大。通?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程b來控制A的讀數(shù)在0.151.00范圍內(nèi)。入射光波長的選擇 為使測定有較高的靈敏度，應(yīng)選擇max作為入射光，但要注意max所在的波峰不能太尖銳，這樣由波長不準(zhǔn)確或非單色光引起偏離朗伯比爾定律的程度較小，測定結(jié)果較準(zhǔn)確。 如果有干擾物質(zhì)存在，應(yīng)根據(jù)“干擾最小，吸收較大”的原則選擇入射光。2 反應(yīng)條件選擇反應(yīng)條件選擇顯色劑的選擇原則： 使配合物吸收系數(shù) 最大、配合物穩(wěn) 定、與配合物吸收波長相差大等。 顯色劑用量： 配位數(shù)

12、與顯色劑用量有關(guān) 溶液酸度： 配位數(shù)和水解等與 pH 有關(guān)。 顯色時(shí)間、溫度、放置時(shí)間等。3 參比液選擇參比液選擇 用適當(dāng)?shù)膮⒈热芤涸谝欢ǖ娜肷涔獠ㄩL下調(diào)節(jié)A=0，可以消除由比色皿、顯色劑、溶劑和試劑對待測組分的干擾。 當(dāng)顯色劑、試劑在測定波長下均無吸收時(shí)，用純?nèi)軇?或H20)作參比溶液，稱溶劑空白； 若顯色劑和其他試劑無吸收，而共存的其他離子有吸收，則用不加顯色劑的試液為參比溶液，稱為“樣品空白” ； 當(dāng)試劑、顯色劑有吸收而試液無色時(shí)，以不加試液的試劑、顯色劑按照操作步驟配成參比溶液，稱為試劑空白。 總之，要求用參比溶液調(diào)A=0后，測得被測組分的吸光度與其濃度的關(guān)系符合朗伯比爾定律。 4 吸

13、光度范圍的選擇吸光度范圍的選擇由計(jì)算可知，當(dāng)透光率T為0.37即吸光度為0.43時(shí)，濃度測量的相對誤差最??；當(dāng)透光率T為0.650.15即吸光度為0.20.8時(shí)，濃度測量的誤差較小，準(zhǔn)確度較高。 這可以通過選擇不同厚度的吸收池和改變試樣的用量及定容體積等方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。控制A在此范圍內(nèi)進(jìn)行測定。 5 配對池的選擇配對池的選擇 吸收池由于在使用過程中受化學(xué)腐蝕或摩擦的程度不同，因此在相同條件下測定的本底吸光度有差異，差異最小的同一規(guī)格的吸收池稱為配對池。 工作時(shí)用空氣或蒸餾水在一定波長下測定吸光度值，選擇配對池投入使用。第六節(jié)、紫外第六節(jié)、紫外可見吸收光譜法的定量分析實(shí)例可見吸收光譜法的定量分析實(shí)

14、例1.銀杏內(nèi)酯最大紫外吸收波長的測定 取銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品100mg，用定容至100mL（1mg/mL），從中取出0.20mL用石油醚定容至10 mL(20g/mL)。為減少測定隨機(jī)性，分別用UV-3000（自動）、UV-754（手動）紫外掃描，得到銀杏內(nèi)酯紫外掃描曲線，結(jié)果見圖。并確定最大吸收波長max=318nm。圖 .銀杏內(nèi)酯紫外掃描曲線 2.2.銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 從標(biāo)樣備用液中抽取50L(5g/mL)、100L、150L 、200L、250L和300L分別用石油醚定容至10 mL，在max分別測定吸光度值，重復(fù)3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定值（=318n

15、m） 標(biāo)樣取量5010015020025030010.1570.294 0.464 0.577 0.746 0.88120.1540.298 0.460 0.577 0.740 0.90430.1590.303 0.467 0.578 0.735 0.890平均值0.15670.2983 0.4637 0.5773 0.7403 0.8917 2.2.銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定圖.銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(UV)y = 0.2917x + 0.0106R2 = 0.998500.20.40.60.8100.511.522.533.5藁本內(nèi)酯濃度 (/100L/mL)紫外吸光度 A3、

16、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 從標(biāo)樣備用液中分別抽取100L用石油醚定容至17號10 mL容量瓶中，測定。結(jié)果見表3。由表可見，該法重現(xiàn)性較好，測量精密度較高。表.重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)編號1234567平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)A318nm0.2980.2860.2940.3010.3090.2970.2940.2970.48%1.617%4、加樣回收率實(shí)驗(yàn)、加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取一銀杏葉樣品，用石油醚轉(zhuǎn)移并定容至100mL，從中分別取出0.5mL置于R0R5共6個(gè)25mL容量瓶中。從標(biāo)樣備用液中分別取出100、200、300、400、500mL置于上述R1R5共5個(gè)容量瓶中。將上述6（R0R5）容量瓶分別定容至25

17、mL測定。結(jié)果見下表。表. 加樣回收實(shí)驗(yàn)平均回收率為97.66%，該法較可靠，測定結(jié)果準(zhǔn)確度較高。樣品號R0R1R2R3R4R5A318nm0.2170.3310.4590.5650.6630.845回收率(%)/97.6103.67599.11795.53792.385、穩(wěn)定性研究、穩(wěn)定性研究 從標(biāo)樣備用液中取出200L定容至10mL，分別于0、30、60、90、120min測max。測定間隙容量瓶密封冷藏保存。結(jié)果見下表。表. 2小時(shí)內(nèi)銀杏內(nèi)酯A318nm的穩(wěn)定性 2小時(shí)內(nèi)銀杏內(nèi)酯A318nm基本不變，表明在石油醚溶液中2小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。 時(shí)間（min）0306090120A318nm0.5770.5850.5720.5690