凝聚胺法交叉配血試驗

1、word整理版凝聚胺法交叉配血試驗操作規(guī)程目的保證交叉配血試驗準確,保證臨床輸血平安.適用范圍XXX醫(yī)院輸血科責(zé)任具有專業(yè)技術(shù)的工作人員主要負責(zé) XXX醫(yī)院輸血標本的交叉配血試驗,但只對 該單份標本負責(zé).相關(guān)文件試劑采購、保存和使用治理程序設(shè)備采購、使用治理程序消毒與清潔治理程序標本采集、運輸、保存和報廢治理程序緊急用血治理程序相關(guān)記錄儀器設(shè)備的采購、使用和維護記錄儀器的溫度記錄恒溫水溫箱的換水和消毒記錄消毒液的配置記錄清潔消毒記錄試劑采購、使用記錄標本交接和報廢記錄交叉配血記錄緊急用血記錄實驗原理紅細胞外表帶有大量的負電荷,以預(yù)防產(chǎn)生自發(fā)性聚集,當(dāng)紅細胞懸浮在電解 質(zhì)中時,陽離子會被紅細胞的

2、負電荷所吸引,此時紅細胞那么被擴散的雙層離子云所 圍繞而形成Zeta電位,Zeta電位決定紅細胞之間的排斥作用.凝聚胺技術(shù)首先利用低離子溶液(LIM)降低介質(zhì)的離子強度,減少紅細胞周圍 的陽離子云,以促進紅細胞與血清(血漿)中的抗體結(jié)合.其次參加的凝聚胺(Polybrene )溶液是一種高價陽離子多聚物、肝素中和劑,溶解后能產(chǎn)生很多正電 荷,可以中和紅細胞外表帶有的負電荷,使紅細胞的Zeta電位降低,縮短紅細胞之間的距離,使紅細胞產(chǎn)生非特異性的凝集.最后參加的懸浮液(Resuspe ndi ng )具有中和凝聚胺(Polybrene )陽離子的作用,使正常的紅細胞非特異性凝集散開,試 驗結(jié)果為

3、陰性；但如果紅細胞被相應(yīng)的抗體致敏,那么會被凝聚胺凝集而不會散開, 試驗結(jié)果為陽性.儀器器械玻璃試管、玻片、記號筆、一次性塑料滴管、顯微鏡、交叉配血專用離心機、 試管架、恒溫水溫箱、試劑保存冰箱、標本保存冰箱.試劑生理鹽水、凝聚胺試劑、Anti-human IgG血清,均為有合格證件的正品.試劑保存和穩(wěn)定性1 凝聚胺試劑須保存在2-25 C 其中陰、陽對照血清應(yīng)儲存在28C.在適當(dāng) 儲存條件下有效期24個月.2. 抗人IgG血清低溫冰箱保存.復(fù)溶后放 2 4°C冰箱保存.3 凝聚胺試劑 低離子介質(zhì)溶液LIM:含葡萄糖,乙二胺四醋酸-2鈉及穩(wěn)定劑. 凝聚胺溶液Polybrene ：含凝

4、聚胺,氯化鈉及穩(wěn)定劑. 復(fù)懸液Resuspending：含檸檬酸鈉,葡萄糖及穩(wěn)定劑. 陽性對照血清：含抗D血清、氯化鈉及穩(wěn)定劑. 陰性對照血清：含AB血漿、氯化鈉及穩(wěn)定劑,不含紅細胞血型抗體.標本收集與處理1、受檢者血清：采集受檢者靜脈血23ml,經(jīng)1000r/min離心1分鐘或室溫靜置 1小時后取上清.2、25%勺受檢者紅細胞：采集受檢者靜脈血或末梢血,先用生理鹽水洗滌紅細 胞3次,再根據(jù)下表進行紅細胞懸液的配制.懸液濃度%壓積紅細胞滴鹽水滴2140(2ml)5116 (0.8ml)3、以上標本有效期為三天；假設(shè)受血者抽取標本后,輸用過血液或血液制品,且 輸用時間超過12小時的,必須重新米集

5、標本.4、標本出現(xiàn)中度以上溶血者,為不合格標本,不能用于檢測.實驗方法與步驟1 、分別制備受血者和獻血者 35%勺紅細胞懸液取2支使管分別標注為受血 者管和獻血者管,再分別參加 2ml生理鹽水,在受血者管參加1滴受血者紅細胞,在 獻血者管參加1滴獻血者紅細胞,混勻后備用.2、取4支使管,分別標注主側(cè)、次側(cè)、陰性對照和陽性對照：主側(cè)管：先參加2滴受血者血清血漿,再參加1滴獻血者25%T細胞懸液；次側(cè)管：先參加2滴獻血者血清血漿,再參加1滴受血者25%T細胞懸液； 陰性對照管：先參加2滴陰性對照血清,再參加1滴獻血者25%T細胞懸液；陽性對 照管：先參加2滴陽性對照血清,再參加1滴獻血者25%1細

6、胞懸液.3、 混勻后各參加LIM溶液0.65ml,輕輕混勻,于室溫下靜置1分鐘.4、 再各參加2滴Polybrene溶液,輕輕混勻,于室溫下靜置 15秒.5、 用交叉配血專用離心機 3400 r/min 相當(dāng)于1000g離心力離心10秒,然 后倒掉上清液不要瀝干,讓管底殘留約0.1 ml液體.6、輕輕搖動試管,目測紅細胞有無凝集,如無凝集,那么必須重做.重做后仍然 沒有凝集現(xiàn)象出現(xiàn),可能試劑失效.7、最后各參加2滴Resuspending溶液,輕輕搖動試管并同時目測凝集是否散開,再進一步倒在玻片上用顯微鏡觀察凝集是否散開.如果在60秒內(nèi)凝集散開,表明是由Polybrene引起的非特異性凝集,配

7、血結(jié)果相合；如果凝集不散開,那么為紅細 胞抗原抗體結(jié)合的特異性反響,配血結(jié)果不相合.如果想進一步檢測 Anti-K抗體,那么必須繼續(xù)做輔助性的抗球蛋白試驗,步驟如下：8、再滴入1滴Resuspending溶液.9、用生理鹽水洗紅細胞35次,并把最后一次上清液完全倒干.10、滴入2滴Anti-human IgG 血清,并混勻.11、用交叉配血專用離心機 3400rpm離心15s.12、 觀察有無凝集反響,如果有凝集反響,表示有 Anti-K抗體,那么必須進一步 做抗體沖出試驗,供血者的血液不適合病人使用.如果沒有凝集反響,為了保證輸血 的平安性,須再各添加1滴致敏性紅細胞至所有沒有凝集的試管中,

8、 混勻,3400rpm 離心1分鐘.正常應(yīng)有2+反響.如果沒有凝集反響,可能是假陰性,輔助性抗球蛋白 試驗必須重做.結(jié)果判斷1、ABC同型配血,主側(cè)和次側(cè)均無溶血及凝集表示無輸血禁忌,可以輸血.2、 如急需輸血但一時無同型血液,作異型配血時指 C型血輸給A,B或AB型, 或A,B型血輸給AB型時,主側(cè)無溶血及凝集,但次側(cè)必然有凝集或溶血.質(zhì)量限制與考前須知1、在進行交叉配血試驗時,一定要嚴格按操作規(guī)程進行,每進行一步操作,必 須進行一次核對,預(yù)防操作錯誤,尤其預(yù)防主側(cè)和次側(cè)加樣加錯.操作方法應(yīng)按規(guī)定 先加血清,然后再加紅細胞懸液,以便核實是否漏加血清.同時,注意區(qū)別凝聚胺所 引起的凝集反響.2

9、、受血者標本有效期為三天；假設(shè)受血者抽取標本后,輸用過血液或血液制品,且輸用時間超過12小時的,必須重新采集標本.25渝細胞懸液要求準確,必要時 用生理鹽水洗滌紅細胞后重新配制.3、如果主側(cè)發(fā)生凝集反響,說明配血不合,不管次側(cè)配血如何都不能輸血.如 果僅次側(cè)配血發(fā)生凝集反響,只有在緊急情況下才有可能考慮是否輸血.4、可以用EDTA抗凝血漿代替血清使用,不能使用溶血標本及含有枸櫞酸鈉、肝 素的抗凝血漿標本.5、加Polybrene溶液離心去上清后不凝集,可能是標本中含有肝素或其它干擾因子.假設(shè)病人血清血漿含有肝素或其它干擾因子,如洗腎患者,需多加46滴Polybrene溶液以中和肝素或其它干擾因

10、子.&紅細胞懸液以35%為宜,過濃或過淡可使抗原抗體比例不適當(dāng),反響不明顯而易誤判.7、 未開封的試劑應(yīng)儲存于溫度在 225C、相對濕度不大于80%無腐蝕性氣體 的環(huán)境中；已開封的試劑應(yīng)儲存于相對濕度不大于 80%無腐蝕性氣體和通風(fēng)良好的 室溫環(huán)境中；試劑用后應(yīng)及時擰緊瓶蓋保存；未開封試劑的有效期為兩年,在有效期內(nèi)已開封的試劑應(yīng)在開封后的6個月內(nèi)使用完.8、試管,滴管吸頭和玻片必須清潔枯燥,預(yù)防溶血.9、離心時間不宜過長或過短,速度不宜過快或過慢,以防假陽性或假陰性結(jié)果.10、各種原因引起的紅細胞溶解,易誤判為不凝集,局部溶血時,可溶性血型物 質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體.11、中國人極少有An

11、ti-K抗體,但其他人種比例較高,尤其是白種人,所以,當(dāng) 病人是其他人種時,為求平安起見,應(yīng)加做輔助性抗球蛋白試驗.加做輔助性抗球蛋 白試驗是為了增加檢測 Anti-K抗體的敏感度,對檢測其他的抗體無幫助.所以,除 非想進一步檢測Anti-K抗體,否那么不須做到輔助性抗球蛋白試驗.12、進行交叉配血前逐項核對輸血申請單、受血者和供血者血樣,復(fù)查受血者和 供血者ABC血型正、反定型,并常規(guī)檢查患者RhD血型,正確無誤時可進行交 叉配血.13、結(jié)果判斷必須先肉眼觀察,再進行顯微鏡觀察.注意觀察弱凝集和排除非特 異性凝集.14、 交叉配血試驗中發(fā)現(xiàn)有不配合時,首先應(yīng)考慮受血者和供血者的ABO血型和

12、RhD血型定型是否錯誤,必要時進行抗體篩檢.其次,應(yīng)注意有無特異性同種抗體,特異性未知的同種抗體存在,或者患者的血清在室溫37C或抗球蛋白血清中凝集所有 的其他紅細胞,造成交叉配血的困難,應(yīng)進一步作有關(guān)試驗進行鑒定.15、兩人值班時,交叉配血試驗由兩人互相核對；一人值班時,操作完畢后自己 復(fù)核,并填寫配血試驗結(jié)果.按“交叉配血核對制度進行.16、 各供血者間需進行交叉配血；已經(jīng)輸注的血液缺乏24小時的,供血者間也 需進行交叉配血.17、凝聚胺試劑還可用于輔助抗體篩檢試驗、輔助性抗人球蛋白試驗和輔助性血 型鑒定.具體操作方法詳見凝聚胺試劑盒使用說明書.18、判斷結(jié)果后應(yīng)仔細核對、記錄,預(yù)防筆誤.

13、交叉配血的影響因素及解決方法準確的交叉配血是臨床平安有效輸血的最后一條重要保證.輸血配合是選擇適合受血者輸注的血液,使輸血的成分能在受血者體內(nèi)有效存活,并且無不良反響,即輸 入的紅細胞在受者體內(nèi)必須不凝集和不溶血,輸入的血漿成分不導(dǎo)致受者自身紅細胞顯著破壞,使受血者恢復(fù)健康.影響交叉配血的因素很多,主要如下：1 、標本 血標本的采集錯誤、稀釋和溶血.另從受檢者采集 I份新鮮血液標本,這樣可 以糾正因污染或搞錯樣本造成的不合. 標本一般要求離體后盡快實驗, 最長不能超過 3天,每次輸血后受血者和供血者的血標本應(yīng)在 28C保存7天. 患者的藥物使用有時也對實驗有一定影響,當(dāng)受血者使用肝素治療時,應(yīng)

14、使用 硫酸魚精蛋白對抗使標本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮 PVp 等治療,應(yīng)注意將紅細胞洗滌. 受檢者紅細胞上抗原位點過少 如亞型或抗原性減弱見于白血病或惡性腫 瘤,以及類B或cisAB等.如疑為A抗原或B抗原減弱,那么可將受檢紅細胞與抗 A或抗一B血清做吸收及放散試驗,以及用受檢者唾液作 A、B、H血型物質(zhì)測定只 對80% HAB分泌型的人有用.如受檢者為A型血而疑為有類B抗原時,可用以下 方法進行鑒別：1觀察細胞與抗一A及抗一B的凝集強度,與抗一A的反響要比與抗 B的反響強,這種區(qū)別用玻片法作試驗更為明顯；2用受檢者紅細胞與自身血清 作試驗,血清中的抗一B不凝集自身紅細胞上

15、的類B抗原；3檢查唾液中是否有A、 B物質(zhì),如果是分泌型,可檢出 A物質(zhì)而無B物質(zhì)；4核對患者的診斷,類B抗原 的形成與結(jié)腸癌、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關(guān). 受檢者血清中蛋白紊亂高球蛋白血癥,或?qū)嶒灂r溫度過高,常引起紅胞呈緡 錢狀排列.如試驗結(jié)果紅細胞呈緡錢狀排列,加等滲鹽水 I滴.混和,往往可使緡錢 現(xiàn)象消失.注意不應(yīng)先加鹽水I滴于受檢者血清中而后和紅細胞做試驗, 以免使血清 中抗體被稀釋. 細菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因.如發(fā)現(xiàn)多凝集現(xiàn)象,應(yīng)考慮由遺傳產(chǎn)生的 Cad抗原活性；被細菌酶激活的T或TK受體；或 產(chǎn)生機制不太明了的Tn受體所引起.多凝集紅細胞具有以

16、下特點：1能被人和許多 家兔的血清凝集；2能與大多數(shù)成年人的血清凝集,不管有無相應(yīng)的同種抗體. 3 不被臍帶血清凝集.4通常不與自身的血清凝集.5如有條件可用外源凝集素加以 鑒別. 檢者血清中缺乏應(yīng)有的抗-A及或抗一B抗體,如丙種球蛋白缺乏癥,老年人血 清中抗體水平大幅度下降等.如果試驗結(jié)果未見凝集,應(yīng)將細胞及血清試驗至少在室 溫和4C放置30min,用顯微鏡檢查核實. 血清中有意外抗體,如自身抗一I,常引起干擾.用A1、A2、B、0紅細胞及自 身紅細胞檢查受檢者血清.如果疑心是抗一I,用0型或ABO相合的臍血紅細胞檢 查. 各種原因引起的紅細胞溶解,誤判為不凝集.局部溶血時,可溶性血型物質(zhì)中

17、 和了相應(yīng)的抗體.將紅細胞洗滌數(shù)次,配成25尬理鹽水細胞懸液,用抗一A、抗一B、 抗一Al,抗一A十B及抗H做試驗可以得到其它有用的信息.對受檢紅細胞作直接抗 球蛋白試驗,如結(jié)果呈陽性,表示紅細胞已被抗體致敏.2、試劑運輸、貯存等條件不適可導(dǎo)致試劑變質(zhì)失效,造成配血錯誤.實驗前進行試劑 外觀、效價等工程質(zhì)量限制.不同抗凝劑制備的標準紅細胞質(zhì)量也不同；另外,紅 細胞懸液過濃或過淡,抗原抗體比例不適當(dāng),使反響不明顯,易誤判為陰性反響.應(yīng) 依據(jù)要求正確配制紅細胞濃度.啟用生理鹽水時,應(yīng)及時貼上啟用時間；超期的試 劑要及時更換.使用過程中,疑心試劑污染時或配血結(jié)果可疑時,必須更換試劑.3 、冷凝集素在

18、ABC血型鑒定和交叉配血的過程中,冷凝集素是影響 ABC血型正反不符和交叉 配血不合的常見原因,尤其是在冬天氣溫較低時,某些病人血清中含有冷凝集素而導(dǎo) 致出現(xiàn)假陽性.正常人血清中冷凝集素效價一般不高,且在4C以下時才有活性.但由于人免疫系統(tǒng)的差異,在惡性腫瘤或病原體感染后有時冷反響性自身抗體可異常增 高,造成溶血性貧血.這種冷凝集素效價在4C可高于1000,用37C生理鹽水洗滌紅 細胞,操作時再置于37T水浴中輕輕搖動可以排除冷凝集素的干擾.4 、自身免疫性溶血性貧血紅細胞被自身抗體強烈致敏后將干擾 ABO定型,且自身抗體的存在會導(dǎo)致交叉配 血不合,選擇適宜的試驗方法對紅細胞上結(jié)合的抗體做放散

19、處理,確定抗體的特異性.如果抗體屬于同種抗體,那么交叉配血時應(yīng)選取該抗原陰性的獻血者的血液.如果該抗 體無法確定特異性,那么交叉配血時要根據(jù)患者自身紅細胞與自身血清的對照反響選取 較弱反響的獻血者血液,由于自身抗體的干擾而發(fā)生ABO正反定型不相符時,可用37 C45 C生理鹽水洗滌紅細胞三次,或者用放散后的紅細胞放散方法需不破壞紅 細胞結(jié)構(gòu),血清定型那么可用洗滌或放散后的紅細胞將血清中的自身抗體吸收后再進 行.5 、弱凝集血型試驗是抗原抗體反響,當(dāng)患者紅細胞上抗原異?；蜓逯写嬖?ABO血型以外 的不規(guī)那么抗體時,可能會導(dǎo)致減弱的或缺少的凝集反響.抗原異常包括：亞型,這 種亞型紅細胞抗原性較弱

20、,可以通過亞型定型試劑來具體定型. 紅細胞抗原形成不 足或敏感性降低,如新生兒、老年人及少數(shù)惡病質(zhì)患者.鑒定血型時要注意正反定型 的結(jié)合,加用抗H和抗A, B型標準血清、A2紅細胞等檢查唾液中的血型物質(zhì),必要 時作吸收放散試驗以確定.假設(shè)血清中存在不規(guī)那么抗體可在反定型用O細胞加以鑒定,有些亞型由于抗原的某些位點缺失, 也會產(chǎn)生相對于缺失抗原位點的抗體,這些抗體的產(chǎn)生有助于亞型的判定.6 、細菌性凝集常見有類B凝集,A型或0型病人因大腸桿菌086感染,從而使紅細胞上獲得類 B抗原,能與抗B抗體發(fā)生凝集,表現(xiàn)為B或AB型.其不受溫度影響,病情好轉(zhuǎn)類B 凝集即消失.另外紅細胞被細菌或細菌酶污染,紅細胞上的T抗原被激活,與供血者中抗T抗體發(fā)生凝集.此種凝集在4°C和37°C之間隨著溫度的升高凝集程度逐漸減弱, 在37C時最弱或消失.7 、混合外觀凝集現(xiàn)象出現(xiàn)混合外觀凝集的情況時一般要核對標