動物胚胎移植技術(shù)及體外受精

1、現(xiàn)代生物技術(shù)家畜育種領(lǐng)域繁殖生物技術(shù)分子生物技術(shù)人工受精技術(shù)胚胎工程技術(shù) 超數(shù)排卵和胚胎移植胚胎性別鑒定體外受精胚胎分割克隆技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 胚胎工程技術(shù)胚胎工程技術(shù) 胚胎移植胚胎移植 胚胎融合胚胎融合 胚胎分割胚胎分割 胚胎的冷凍保存胚胎的冷凍保存 早期胚胎培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng) 胚細胞核移植胚細胞核移植一、胚胎移植一、胚胎移植 受精卵移植受精卵移植 把一頭雌性動物的早期胚胎從輸卵管或子宮中沖洗出來，移植把一頭雌性動物的早期胚胎從輸卵管或子宮中沖洗出來，移植到另一頭雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體到另一頭雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的技術(shù)。的技術(shù)。 供體供體 提供胚

2、胎的動物提供胚胎的動物 受體受體 接受和孕育胚胎的動物接受和孕育胚胎的動物1.1.胚胎移植的生理學基礎(chǔ)胚胎移植的生理學基礎(chǔ) 成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達數(shù)十個卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達數(shù)十個 每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育 早期胚胎處于游離狀態(tài)早期胚胎處于游離狀態(tài) 胚胎發(fā)育不存在免疫問題胚胎發(fā)育不存在免疫問題 胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系 胚胎的遺傳性不受受體的影響胚胎的遺傳性

3、不受受體的影響2. 2. 胚胎移植的基本原則胚胎移植的基本原則 胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性 供體和受體在分類學上的相同屬性供體和受體在分類學上的相同屬性 動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性 動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性 胚胎的發(fā)育期限：胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi)必須處于周期黃體期內(nèi) 胚胎的質(zhì)量：胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響良因素的影響3 3、胚胎移植、胚胎移植 供

4、受體的選擇與管理供受體的選擇與管理 供體的超數(shù)排卵處理和配種供體的超數(shù)排卵處理和配種 受體的同期發(fā)情處理受體的同期發(fā)情處理 胚胎回收胚胎回收 胚胎檢查胚胎檢查 胚胎移植胚胎移植1 1）供受體的選擇與管理）供受體的選擇與管理 供體的選擇供體的選擇 遺傳價值：生產(chǎn)性能優(yōu)秀的母畜遺傳價值：生產(chǎn)性能優(yōu)秀的母畜 健康狀況健康狀況:身體健康，營養(yǎng)水平中等以上的未孕動物身體健康，營養(yǎng)水平中等以上的未孕動物 繁殖性能：達到配種年齡以上繁殖機能正常的母畜繁殖性能：達到配種年齡以上繁殖機能正常的母畜 受體的選擇受體的選擇 身體健康，身體狀況中上的適繁未孕個體，無生殖道疾病和難身體健康，身體狀況中上的適繁未孕個體，

5、無生殖道疾病和難產(chǎn)病史產(chǎn)病史 繁殖狀況正常，有正常的發(fā)情周期繁殖狀況正常，有正常的發(fā)情周期 母性良好：泌乳性能、護仔性能母性良好：泌乳性能、護仔性能 供、受的管理供、受的管理 防疫、記錄防疫、記錄 飼養(yǎng)管理等飼養(yǎng)管理等2 2）、超數(shù)排卵）、超數(shù)排卵 超排超排：以各種外源性促性腺激素誘發(fā)動物卵巢的許多卵泡發(fā)育并排出具有受：以各種外源性促性腺激素誘發(fā)動物卵巢的許多卵泡發(fā)育并排出具有受精能力的卵子。精能力的卵子。 孕母馬促性腺激素、促卵泡素、孕母馬促性腺激素、促卵泡素、前列腺素、促排卵類藥物、孕激素前列腺素、促排卵類藥物、孕激素 超數(shù)排卵處理的時期應選擇在發(fā)情周期的后期，即黃體消退時期。超數(shù)排卵處理

6、的時期應選擇在發(fā)情周期的后期，即黃體消退時期。 個體對超排處理的反應效果難以預測；個體對超排處理的反應效果難以預測； 產(chǎn)生不良的后果：胚胎死亡產(chǎn)生不良的后果：胚胎死亡 卵母細胞蛋白質(zhì)合成過程發(fā)生改變卵母細胞蛋白質(zhì)合成過程發(fā)生改變 生殖道機能產(chǎn)生影響生殖道機能產(chǎn)生影響 3 3）同期發(fā)情（）同期發(fā)情（synchronization synchronization of eatrusof eatrus） 采用激素或類激素的藥物處理，使這一群母畜在特定時間內(nèi)集中發(fā)情和采用激素或類激素的藥物處理，使這一群母畜在特定時間內(nèi)集中發(fā)情和排卵。排卵。 即將母畜的黃體期延長或縮短，使母畜擺脫內(nèi)、外孕激素對卵巢的控

7、制，即將母畜的黃體期延長或縮短，使母畜擺脫內(nèi)、外孕激素對卵巢的控制，在同一時間內(nèi)引起全部母畜的卵泡發(fā)育，從而達到同期發(fā)情的目的。在同一時間內(nèi)引起全部母畜的卵泡發(fā)育，從而達到同期發(fā)情的目的。 延長黃體期：孕激素延長黃體期：孕激素 控制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)控制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn) 縮短黃體期：前列腺素縮短黃體期：前列腺素 加速黃體退化，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制加速黃體退化，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制 促進卵泡發(fā)育、排卵：促性腺激素促進卵泡發(fā)育、排卵：促性腺激素 4 4）胚胎回收）胚胎回收 利用沖胚液從供體的生殖道中沖洗出來，提供移植或其它胚胎工程用。利用沖胚液從供體的生殖道中沖洗

8、出來，提供移植或其它胚胎工程用。 手術(shù)法手術(shù)法 非手術(shù)法非手術(shù)法5 5）胚胎檢查）胚胎檢查胚胚胎胎早早期期發(fā)發(fā)育育胚胎質(zhì)量評價：胚胎質(zhì)量評價： 透明帶的形態(tài)和完整性透明帶的形態(tài)和完整性 胚胎的發(fā)育與胚齡是否一致胚胎的發(fā)育與胚齡是否一致 胚胎的形態(tài)與勻稱性，胚內(nèi)細胞大小的變化胚胎的形態(tài)與勻稱性，胚內(nèi)細胞大小的變化 細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)及顏色，胚內(nèi)是否出現(xiàn)空泡，細胞碎細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)及顏色，胚內(nèi)是否出現(xiàn)空泡，細胞碎片，有無游離細胞片，有無游離細胞 如如A A級：級： 為優(yōu)良胚胎，形態(tài)典型，卵裂球輪廓清晰，為優(yōu)良胚胎，形態(tài)典型，卵裂球輪廓清晰，緊密充實，大小均一，細胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布均緊密充實，大小均一，細胞

9、質(zhì)致密，色調(diào)和分布均一一。 胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間 體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育 胚胎冷凍：胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中6 6）胚胎的保存）胚胎的保存胚胎冷凍的原理胚胎冷凍的原理 胚胎冷凍實際是脫水的過程，胚胎冷凍實際是脫水的過程，冷凍保存的關(guān)鍵是設(shè)法減少細胞內(nèi)冰晶對胚冷凍保存的關(guān)鍵是設(shè)法減少細胞內(nèi)冰晶對胚胎的損傷。胎的損傷。 冷凍過程中，水分形成冰晶造成細胞機

10、械損傷，同時，導致未結(jié)冰的細胞冷凍過程中，水分形成冰晶造成細胞機械損傷，同時，導致未結(jié)冰的細胞內(nèi)溶液滲透壓急劇升高，造成蛋白質(zhì)變性，導致死胎。內(nèi)溶液滲透壓急劇升高，造成蛋白質(zhì)變性，導致死胎。 受精卵移植受精卵移植 一般供體為良種或優(yōu)良個體，而受體為生產(chǎn)性能較差的個體或品種。一般供體為良種或優(yōu)良個體，而受體為生產(chǎn)性能較差的個體或品種。 “借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎”選擇選擇供體母牛供體母牛受體母牛受體母牛同期發(fā)情處理同期發(fā)情處理超數(shù)排卵超數(shù)排卵供體公牛供體公牛配種配種沖卵沖卵質(zhì)量檢查、培養(yǎng)質(zhì)量檢查、培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植妊娠檢查妊娠檢查分娩（胚胎移植的犢牛）分娩（胚胎

11、移植的犢牛）胚胎移植的基本程序 6)6)胚胎移植的應用范圍胚胎移植的應用范圍 在家畜改良方面的應用在家畜改良方面的應用 在特定品種擴繁上的應用在特定品種擴繁上的應用 在動物生物多樣性上的應用在動物生物多樣性上的應用 其它方面應用：轉(zhuǎn)基因動物、性別控制、體外受精其它方面應用：轉(zhuǎn)基因動物、性別控制、體外受精在家畜改良方面的應用在家畜改良方面的應用 人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能。但人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能。但對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更

12、是如此。力較低的畜種更是如此。 通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（multiple ovulation and multiple ovulation and embryo transfer: MOET)embryo transfer: MOET)牛羊的生長性狀年遺傳進展可比正常繁殖牛羊的生長性狀年遺傳進展可比正常繁殖提高提高80%80%和和70%70%；產(chǎn)奶性狀提高；產(chǎn)奶性狀提高33%33%。在特定品種擴繁上的應用在特定品種擴繁上的應用 牛羊等低繁殖力家畜，從引進到形成一個純種群體需要牛羊等低繁殖力家畜，從引進到形成一個純種群體需要7-87-8個世代，個世代，15-201

13、5-20年。年。而采用而采用MEOTMEOT法，一次就可獲得一個純種群體。法，一次就可獲得一個純種群體。 8080年代初，美、澳、新從歐洲引進的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴繁。年代初，美、澳、新從歐洲引進的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴繁。 20002000年前后，我國的波爾山羊也是采用胚胎移植進行擴繁的。年前后，我國的波爾山羊也是采用胚胎移植進行擴繁的。在動物生物多樣性上的應用在動物生物多樣性上的應用 在保護動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎在保護動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)越來越發(fā)揮出重要作用。移植技術(shù)越來越發(fā)

14、揮出重要作用。 冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細胞，但該種動物雌性個體的減冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細胞，但該種動物雌性個體的減少，也是這種動物的胚胎或生殖細胞無法得到移植，科學家開始研究在該種動物少，也是這種動物的胚胎或生殖細胞無法得到移植，科學家開始研究在該種動物的亞種或親緣種中試驗，并取得一些成功。如斑馬胚胎移植給馬，蒙古馬胚胎移的亞種或親緣種中試驗，并取得一些成功。如斑馬胚胎移植給馬，蒙古馬胚胎移植給驢，白肢野牛移植給荷斯坦牛。植給驢，白肢野牛移植給荷斯坦牛。其它方面應用其它方面應用 胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程 體外受精必須借助

15、胚胎移植實現(xiàn)體外受精必須借助胚胎移植實現(xiàn)“試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育 轉(zhuǎn)基因及動物生物反應器的研究也必須借助胚胎移植轉(zhuǎn)基因及動物生物反應器的研究也必須借助胚胎移植二、胚胎分割技術(shù)二、胚胎分割技術(shù)1 1）. .概念概念: : 采用采用顯微手術(shù)（機械方法）顯微手術(shù)（機械方法）的方法將早期胚胎的方法將早期胚胎分割成分割成2 2分胚分胚,4,4分胚或分胚或8 8分胚分胚, ,經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)后植入受體，以得到同卵雙胎或同卵多胎的技術(shù)后植入受體，以得到同卵雙胎或同卵多胎的技術(shù). . 胚胎分割以增加優(yōu)秀遺傳性狀的動物數(shù)量為主要目的，可提高胚胎移植技術(shù)的胚胎分割以增加優(yōu)秀遺傳性狀的

16、動物數(shù)量為主要目的，可提高胚胎移植技術(shù)的效率和效益。效率和效益。2 2）胚胎分割的理論依據(jù)）胚胎分割的理論依據(jù) 大多數(shù)哺乳動物早期胚胎屬調(diào)整發(fā)育類型，去掉早期胚胎的一半，剩余的大多數(shù)哺乳動物早期胚胎屬調(diào)整發(fā)育類型，去掉早期胚胎的一半，剩余的部分仍發(fā)育成完整的胚胎。部分仍發(fā)育成完整的胚胎。至少在至少在8 8細胞前，每個分裂球都有相同的發(fā)育能細胞前，每個分裂球都有相同的發(fā)育能力。力。 到到晚桑椹胚時晚桑椹胚時，胚胎發(fā)生初步分化，這時進行胚胎分割，可以重新發(fā)育到，胚胎發(fā)生初步分化，這時進行胚胎分割，可以重新發(fā)育到囊胚。囊胚。2 2）. .特點特點: : 后代具有相同的遺傳物質(zhì)后代具有相同的遺傳物質(zhì).

17、 . 胚胎克隆胚胎克隆. .3 3）. .選擇的胚胎選擇的胚胎: : 發(fā)育良好的發(fā)育良好的, ,形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚. .4 4）. .使用的主要儀器：使用的主要儀器： 實體顯微鏡和顯微操作儀實體顯微鏡和顯微操作儀5 5）. .應用應用: : 為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、性別控制技術(shù)提供活胚材料為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、性別控制技術(shù)提供活胚材料注意：注意：對囊胚階段的胚胎進行分割時，要將內(nèi)細胞團均對囊胚階段的胚胎進行分割時，要將內(nèi)細胞團均等分割。等分割。原因：內(nèi)細胞團一般到囊胚階段才出現(xiàn)，它是發(fā)育為胚胎本原因：內(nèi)細胞團一般到囊胚階段才出現(xiàn)，它是發(fā)育為胚胎本身的基礎(chǔ)細胞，其他細胞為滋養(yǎng)細胞，只為胚

18、胎和胎兒發(fā)育身的基礎(chǔ)細胞，其他細胞為滋養(yǎng)細胞，只為胚胎和胎兒發(fā)育提供營養(yǎng)。若分割時不能將內(nèi)細胞團均等分割，會出現(xiàn)含內(nèi)提供營養(yǎng)。若分割時不能將內(nèi)細胞團均等分割，會出現(xiàn)含內(nèi)細胞團多的部分正常發(fā)育的能力強，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)細胞團多的部分正常發(fā)育的能力強，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育等問題。育不良，甚至不能發(fā)育等問題。胚胎分割技術(shù)也是動物克隆的方法之一胚胎分割技術(shù)也是動物克隆的方法之一 胚胎分割的份數(shù)越多，操作的難度會越大，移植的成功率也越低。 早期胚胎的體積很小，只有在顯微鏡下才能看到；早期胚胎的體積很小，只有在顯微鏡下才能看到； 細胞數(shù)目是有限的：分割的份數(shù)越多，不但難以做到均等細

19、胞數(shù)目是有限的：分割的份數(shù)越多，不但難以做到均等分割，每一份的細胞數(shù)會越少，作為囊胚期的胚胎內(nèi)細胞團分割，每一份的細胞數(shù)會越少，作為囊胚期的胚胎內(nèi)細胞團細胞所受的影響會更大；細胞所受的影響會更大； 分割的份數(shù)越多，技術(shù)的難度會越大，移植后的恢復和發(fā)分割的份數(shù)越多，技術(shù)的難度會越大，移植后的恢復和發(fā)育的難度會越大，移植成功率自然會降低。育的難度會越大，移植成功率自然會降低。 三、胚胎細胞核移植將未著床的早期胚胎分散成單個的細胞，用電融合將未著床的早期胚胎分散成單個的細胞，用電融合方法，使單個細胞與去除細胞核的未受精的成熟的方法，使單個細胞與去除細胞核的未受精的成熟的卵母細胞融合。體外培養(yǎng)發(fā)育成胚

20、胎后，移入受體卵母細胞融合。體外培養(yǎng)發(fā)育成胚胎后，移入受體妊娠產(chǎn)子。妊娠產(chǎn)子。已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等動物上成功。已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等動物上成功。四、性別控制與胚胎性別鑒定四、性別控制與胚胎性別鑒定 動物的性別控制(sex control)技術(shù)是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)。 X、Y精子分離技術(shù)：流式細胞儀 胚胎性別診斷 早期胚胎的性別鑒定早期胚胎的性別鑒定1 1）、核型分析：分析部分胚胎細胞的染色體的組成）、核型分析：分析部分胚胎細胞的染色體的組成2 2）、SRYSRY片段片段的的PCRPCR擴增擴增Y染色體上的特異片段3

21、）、H-YH-Y抗原：雄性特異性弱組織相容性抗原：雄性特異性弱組織相容性Y Y抗抗原原 只有只有Y Y 精子才能表達精子才能表達H-YH-Y抗原?？乖?利用利用H-Y H-Y 抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的H-YH-Y抗原，再通過一定的分離程序，就能將精子抗原，再通過一定的分離程序，就能將精子分離成分離成H-YH-Y+ +(Y(Y精子精子) )和和H-YH-Y- -(X(X精子精子) )兩類，將所需性別的精子進行人工受精，即可獲得兩類，將所需性別的精子進行人工受精，即可獲得預期性別的后代。預期性別的后代。 測定胚胎上測定胚胎上H-YH-Y抗原的存在與否對胚胎的性別作出鑒定抗

22、原的存在與否對胚胎的性別作出鑒定意義意義 通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀制的生產(chǎn)性狀( (如泌乳如泌乳) )和受性別影響的生產(chǎn)性狀和受性別影響的生產(chǎn)性狀( (如生長速度、肉質(zhì)等如生長速度、肉質(zhì)等) )的最大經(jīng)濟效益。的最大經(jīng)濟效益。 控制后代的性別比例可增加選種強度，加快育種控制后代的性別比例可增加選種強度，加快育種進程。進程。 控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害。孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害。五、早期胚胎培養(yǎng)五、早期胚胎培養(yǎng) 發(fā)育阻斷

23、：早期胚胎停頓在某個特定發(fā)育時期，不能繼續(xù)發(fā)育。發(fā)育阻斷：早期胚胎停頓在某個特定發(fā)育時期，不能繼續(xù)發(fā)育。 時間隨動物種不同而異時間隨動物種不同而異 培養(yǎng)條件不完備培養(yǎng)條件不完備 添加各種生長因子可促進胚胎發(fā)育添加各種生長因子可促進胚胎發(fā)育 與某些體細胞共同培養(yǎng)與某些體細胞共同培養(yǎng) 飼養(yǎng)性細胞，通過分泌某些飼養(yǎng)性細胞，通過分泌某些有利于胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)因子有利于胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)因子 體外受精體外受精(In Vitro Fertilization)(In Vitro Fertilization)是指哺乳動物是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境

24、中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為程的技術(shù)，英文簡稱為IVFIVF。 在生物學中，把體外授精胚胎移植到母體后獲得的在生物學中，把體外授精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物動物稱試管動物(test-tube animal)(test-tube animal)。 第二節(jié)體外受精第二節(jié)體外受精我國奶牛問題.人工授精人工授精(AI)一、基本原理：一、基本原理：人工模擬體人工模擬體內(nèi)環(huán)境（包括營養(yǎng)、溫度、內(nèi)環(huán)境（包括營養(yǎng)、溫度、PHPH等），使初級卵母細胞成等），使初級卵母細胞成熟，同時使精子獲能，最終熟，同時使精子獲能，最終完成受精作用，并有計劃地完成受精作用，并有計劃地保存胚胎保存胚胎二、體外受精技

25、術(shù)發(fā)展的歷史 體外受精研究有體外受精研究有100100多年歷史多年歷史 18781878年德國年德國SehenkSehenk在家兔和豚鼠進行了嘗試在家兔和豚鼠進行了嘗試 19541954年張民覺獲得首例體外受精兔年張民覺獲得首例體外受精兔 19631963年金黃倉鼠體外受精獲得成功，開創(chuàng)了精子體外獲能成功的先例年金黃倉鼠體外受精獲得成功，開創(chuàng)了精子體外獲能成功的先例 19901990年我國錢菊芬獲得首例試管山羊年我國錢菊芬獲得首例試管山羊 旭日干、范必勤等獲得試管牛犢旭日干、范必勤等獲得試管牛犢三、意義三、意義 體外受精技術(shù)對動物生殖機理研究、畜牧生產(chǎn)、體外受精技術(shù)對動物生殖機理研究、畜牧生產(chǎn)

26、、醫(yī)學和瀕危動物保護等具有重要意義。醫(yī)學和瀕危動物保護等具有重要意義。 在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值。重要價值。 哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分?，F(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分。四、體外受精技術(shù)環(huán)節(jié)四、體外受精技術(shù)環(huán)節(jié) 卵母細胞的獲得和體外成熟卵母細胞的獲得和體外成熟 精子的體外獲能

27、精子的體外獲能 成熟卵母細胞與獲能精子的體外受精成熟卵母細胞與獲能精子的體外受精 受精卵的體外培養(yǎng)受精卵的體外培養(yǎng) 受精卵的移植受精卵的移植體外受精獲能次級卵母細胞減數(shù)第二次分裂中期1 1卵母細胞的獲得與體外成熟卵母細胞的獲得與體外成熟1 1）卵細胞的采集方法）卵細胞的采集方法獲得足夠數(shù)量的卵母細胞是生產(chǎn)試管動物的前提。獲得足夠數(shù)量的卵母細胞是生產(chǎn)試管動物的前提。（1 1）從屠宰場家畜卵巢中采集，）從屠宰場家畜卵巢中采集，（2 2）從超數(shù)排卵的卵巢獲得卵泡。借助腹腔鏡，手術(shù)法取卵）從超數(shù)排卵的卵巢獲得卵泡。借助腹腔鏡，手術(shù)法取卵（3 3）陰道超聲波監(jiān)視穿刺法直接從牛卵巢收集卵母細胞和內(nèi)窺鏡借助

28、套筒穿刺陰道）陰道超聲波監(jiān)視穿刺法直接從牛卵巢收集卵母細胞和內(nèi)窺鏡借助套筒穿刺陰道穹隆獲得。穹隆獲得。卵母細胞的采集卵母細胞的采集.2 2）卵母細胞的成熟）卵母細胞的成熟 未成熟的卵母細胞的核在細胞中央，成熟過程中遷移到動物極質(zhì)膜下，核未成熟的卵母細胞的核在細胞中央，成熟過程中遷移到動物極質(zhì)膜下，核變得膨大，改稱發(fā)生泡，接著進行第一次成熟分裂，變得膨大，改稱發(fā)生泡，接著進行第一次成熟分裂，減數(shù)分裂的完成標志減數(shù)分裂的完成標志著卵母細胞核的成熟。著卵母細胞核的成熟。（1 1） 細胞核成熟細胞核成熟（2 2） 細胞質(zhì)的成熟細胞質(zhì)的成熟 顯著的蛋白質(zhì)合成發(fā)生在生發(fā)泡破裂前后，這些新合成的顯著的蛋白質(zhì)

29、合成發(fā)生在生發(fā)泡破裂前后，這些新合成的蛋白質(zhì)不僅與卵細胞自身成熟有關(guān)（激活成熟促進因子），蛋白質(zhì)不僅與卵細胞自身成熟有關(guān)（激活成熟促進因子），而且與卵母細胞輸精后的發(fā)育能力直接有關(guān)。所以而且與卵母細胞輸精后的發(fā)育能力直接有關(guān)。所以細胞質(zhì)細胞質(zhì)成熟的質(zhì)量如何直接影響到早期胚胎的發(fā)育能力。成熟的質(zhì)量如何直接影響到早期胚胎的發(fā)育能力。 胞質(zhì)成熟主要表現(xiàn)為細胞器變化和紡錘體的形成。胞質(zhì)成熟主要表現(xiàn)為細胞器變化和紡錘體的形成。 卵母細胞成熟后期細胞器完成重新組裝，如高爾基體消失，卵母細胞成熟后期細胞器完成重新組裝，如高爾基體消失，線粒體分布核的周圍，胞質(zhì)內(nèi)有線粒體分布核的周圍，胞質(zhì)內(nèi)有PASPAS陽性的

30、囊膜和脂滴。陽性的囊膜和脂滴。（3 3）細胞膜和透明帶的成熟）細胞膜和透明帶的成熟 細胞膜穩(wěn)定性發(fā)生改變，膜微絨毛發(fā)生重排，表現(xiàn)密集而有彎曲，并從透明帶內(nèi)退出或斷裂細胞膜穩(wěn)定性發(fā)生改變，膜微絨毛發(fā)生重排，表現(xiàn)密集而有彎曲，并從透明帶內(nèi)退出或斷裂 透明帶外層呈網(wǎng)狀，變軟。透明帶外層呈網(wǎng)狀，變軟。2 2、體外獲能、體外獲能 指精子在體外獲得受精能力的過程。指精子在體外獲得受精能力的過程。 包括在體外環(huán)境中除去精漿和精子表面吸附的大分子物質(zhì)，減少表面陰性電荷，提高膜流動性，增加精子包括在體外環(huán)境中除去精漿和精子表面吸附的大分子物質(zhì)，減少表面陰性電荷，提高膜流動性，增加精子呼吸率和加快運動幅度等一系列

31、生理生化過程。呼吸率和加快運動幅度等一系列生理生化過程。 精子體外獲能是體外受精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，精子體外獲能是體外受精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要包括主要包括精子精子的洗滌的洗滌和和添加特定成分添加特定成分 BrackettBrackett（19821982）以）以高離子強度液高離子強度液處理使精子獲能處理使精子獲能 鈣離子鈣離子在精子獲能時起關(guān)鍵作用，能較快的誘發(fā)精子超活在精子獲能時起關(guān)鍵作用，能較快的誘發(fā)精子超活化運動和頂體反應?；\動和頂體反應。 氨基多糖（氨基多糖（GAGsGAGs）是牛精子獲能的主要物質(zhì)，可促進對是牛精子獲能的主要物質(zhì)，可促進對鈣離子的吸收，誘發(fā)頂體反應。如肝素也可使精子獲能

32、，鈣離子的吸收，誘發(fā)頂體反應。如肝素也可使精子獲能，但同樣是一個鈣離子依賴的過程。但同樣是一個鈣離子依賴的過程。 血清白蛋白（血清白蛋白（BSABSA）也可誘發(fā)精子獲能?？赡茏鳛橐部烧T發(fā)精子獲能?？赡茏鳛閆nZn離子離子融合劑引起融合劑引起PLAPLA2 2的表達，或者在獲能中去除精子膜上的膽的表達，或者在獲能中去除精子膜上的膽固醇。固醇。3 3、 體外受精體外受精 體外受精是以正常體內(nèi)受精的研究為基礎(chǔ)的，盡可能給精體外受精是以正常體內(nèi)受精的研究為基礎(chǔ)的，盡可能給精卵提供一個適卵提供一個適宜的共培養(yǎng)體系是研究體外受精的目的。宜的共培養(yǎng)體系是研究體外受精的目的。 受精成功的標志是看受精卵是否可發(fā)

33、育至囊胚期階段。受精成功的標志是看受精卵是否可發(fā)育至囊胚期階段。 多精子受精一直是體外受精的一個難點多精子受精一直是體外受精的一個難點4 4、受精卵的體外培養(yǎng)、受精卵的體外培養(yǎng) 受精卵要在體外條件下培養(yǎng)發(fā)育一段時間，再移植到受體子宮內(nèi)，因此，受精卵要在體外條件下培養(yǎng)發(fā)育一段時間，再移植到受體子宮內(nèi)，因此，“試管試管動物動物”實際上要在體外進行三個階段的培養(yǎng)：實際上要在體外進行三個階段的培養(yǎng)： 第一階段第一階段是卵子成熟培養(yǎng)和精子獲能培養(yǎng)；是卵子成熟培養(yǎng)和精子獲能培養(yǎng)； 第二階段第二階段是受精培養(yǎng)；是受精培養(yǎng)； 第三階段第三階段才是受精卵早期發(fā)育培養(yǎng)。才是受精卵早期發(fā)育培養(yǎng)。 5、存在的問題 1

34、）體外受精的效率有待提高 2）體外培養(yǎng)體系有待進一步完善 3）基礎(chǔ)理論研究有待加強作業(yè)1 1、概念、概念 胚胎移植、超速排卵、同期發(fā)情、胚胎分割、發(fā)育阻斷、體外受精、精子獲能胚胎移植、超速排卵、同期發(fā)情、胚胎分割、發(fā)育阻斷、體外受精、精子獲能2 2、簡答、簡答 胚胎移植的生理學基礎(chǔ)胚胎移植的生理學基礎(chǔ) 胚胎移植的基本原則胚胎移植的基本原則 牛胚胎移植基本程序牛胚胎移植基本程序 延長黃體期：孕激素延長黃體期：孕激素 控制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)控制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn) 縮短黃體期：前列腺素縮短黃體期：前列腺素 加速黃體退化，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制加速黃體退化，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素

35、的控制 促進卵泡發(fā)育、排卵：促性腺激素促進卵泡發(fā)育、排卵：促性腺激素 在家畜改良方面的應用在家畜改良方面的應用 人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能。但人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能。但對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更是如此。力較低的畜種更是如此。 通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（multiple ovulation and multiple ovulation and embryo transfer: MOET)embryo transfer: MOET)牛羊的生長性狀年遺傳進展可比正常繁殖牛羊的生長性狀年遺傳進展可比正常繁殖提高提高80%80%和和70%70%；產(chǎn)奶性狀提高；產(chǎn)奶性狀提高33%33%。在動物生物多樣性上的應用在動物生物多樣性上的應用 在保護動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎在保護動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)越來越發(fā)揮出重要作用。移植技術(shù)越來越發(fā)揮出重要作用。 冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細胞，但該種動物雌性個體的減冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細