基因工程常用技術(shù)

1、第三章 基因工程常用技術(shù)一、質(zhì)粒DNA的提取二、核酸凝膠電泳技術(shù)三、核酸分子雜交技術(shù)四、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)五、DNA序列分析技術(shù) 質(zhì)粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技術(shù)，最常用的是堿裂解法。 一、質(zhì)粒DNA的提取 在強(qiáng)堿性溶液中，DNA雙鏈的氫鍵斷裂變性；當(dāng)溶液恢復(fù)中性時(shí)，DNA雙鏈復(fù)性。（一）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1、原理4 在變性后雙鏈不分離、復(fù)性快。共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA：5強(qiáng)堿性 變性后雙鏈分離、難以復(fù)性而形成纏繞結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，離心時(shí)沉淀。線性染色體DNA：2、堿裂解法質(zhì)粒DNA提取的步驟 1）溶菌使用“溶液 I”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。溶液 I：50

2、mM 葡萄糖25mM Tris-HCl(pH8.0)10mM EDTA4-5mg/ml 溶菌酶7葡萄糖： 增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力的作用而降解（震蕩）。EDTA： Mg2+、Ca2+螯合劑，抑制DNase活性，防止DNA被降解。8溶菌酶： 為糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分-肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，具有溶菌作用 。2）變性 加入“溶液II”，使細(xì)菌細(xì)胞膜破壞、使蛋白質(zhì)和DNA變性。溶液 II： 0.2N NaOH（10N貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)?1% SDS10NaOH： 是強(qiáng)堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 是離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白，

3、并結(jié)合成“蛋白質(zhì)-SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性沉淀。SDS：113）中和 加入“溶液III”使DNA復(fù)性、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。溶液 III： 5N KAc 60ml 冰HAc 11.5ml 水 8.5ml12KAc： 用冰HAc把KAc溶液的pH調(diào)到4.8，以中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。 高濃度KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物沉淀。冰HAc ：13上清液中含有質(zhì)粒DNA。4）離心去除沉淀5）純化DNA 酚-氯仿-異戊醇（25: 24: 1）抽提或柱層析。15酚： 比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相

4、中的酚。 蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 防止抽提時(shí)振蕩起泡。氯仿：異戊醇：16 2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA。6）沉淀DNA DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。 17 70%乙醇洗滌DNA，干燥。7）洗滌8）貯存 用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，貯存于-20。18TE： 由Tris-HCl緩沖液和EDTA配制。 EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。 Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸或硼酸緩沖液），利于后續(xù)操作。 RNaseA： 降解殘留的RNA。 許多公司研制出商品化質(zhì)粒提取試劑盒，原理大多依照堿裂解

5、法，但在純化步驟上采用柱層析。 203、影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素 質(zhì)粒的產(chǎn)量受提取過(guò)程中各因素的影響，但最重要的是菌株的遺傳背景和質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。 一般使用endA基因突變的E.coli菌株，如DH5、JM109等。 1）受體菌株 endA基因編碼核酸內(nèi)切酶I，在Mg2+存在下，可將雙鏈DNA消化為7bp的寡核苷酸片斷。22是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。2）質(zhì)粒拷貝數(shù)3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)?？截悢?shù)低。常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量pUC pGEMpBR322ColE1pSC1012.7 kb2.7 kb4.4 kb4.5 kb9.0 kb500-700300-700 25 1562.9-4.11

6、.8-4.10.320.150.12質(zhì)粒 分子大小 拷貝數(shù) 質(zhì)粒產(chǎn)量 （kb） （g/ml）（二）DNA的定量和純度測(cè)定1、紫外光譜法原理：基于DNA在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰（蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。 在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml。26純DNA樣品：OD260/OD280 =1.8 OD260/OD230 2.0OD260/OD230 2.0：有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)， 如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD280 1.9：有RNA污染；27原理：利用溴化乙錠(EB)能插入DNA分子中，在

7、紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，將其熒光強(qiáng)度與已知濃度的DNA(如DNA marker)電泳條帶對(duì)比，可估算出DNA含量。2、瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)（三）DNA分子量的估計(jì) 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA marker對(duì)比得知。 二、核酸凝膠電泳技術(shù)（一）電泳的基本原理 生物大分子在一定pH條件下，通常帶電荷，將其置于電場(chǎng)中，會(huì)以一定的速度向與其電荷性質(zhì)相反的電極遷移，遷移速度稱(chēng)電泳速率。 30 摩擦系數(shù)與分子的大小、構(gòu)型及介質(zhì)的粘度有關(guān)。 電泳速率與電場(chǎng)強(qiáng)度、分子所帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 在生理?xiàng)l件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，故DNA實(shí)際上

8、呈多聚陰離子狀態(tài)，在電場(chǎng)中向 方向遷移。 糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上重復(fù)，故等量的雙鏈DNA幾乎帶等量的凈電荷。正極32 如電場(chǎng)強(qiáng)度一定、電泳介質(zhì)相同，電泳速率就取決于核酸分子的大小和構(gòu)型。構(gòu)型相似的分子：分子量越大、遷移越慢。 分子量相同的分子(如質(zhì)粒)： cccDNA遷移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。33固體支持介質(zhì)：瓊脂糖(agarose) 聚丙烯酰胺(polyarylamide) 固體支持介質(zhì)可形成復(fù)雜的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，DNA穿過(guò)這些網(wǎng)孔才能到達(dá)正極。 分子量小、結(jié)構(gòu)致密的DNA分子更易穿過(guò)網(wǎng)孔，泳動(dòng)速度也越快。 （二）瓊脂糖凝膠電泳 是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。瓊

9、脂糖：37瓊脂糖凝膠： 瓊脂糖在電泳液中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后凝固成均勻的膠體“胨”，成為很好的電泳介質(zhì)。38瓊脂糖濃度(%) 分離DNA的范圍(kb)0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-10 0.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-4 2.0 0.1-3 瓊脂糖濃度的高低決定凝膠孔隙的大小，濃度越高、孔隙越小、分辨率越高。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺： 由丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。 40 在過(guò)硫酸銨和TEMED存在時(shí)，丙烯酰胺單體形成長(zhǎng)鏈，由N,N-甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團(tuán)和鏈末端的自由基團(tuán)反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)，形成聚丙烯酰胺。 為中樞神經(jīng)毒物，盡

10、量避免接觸和吸入!過(guò)硫酸銨： 催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，加速聚合。 丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺： 堿性條件下產(chǎn)生自由基。TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二銨)：42聚丙烯酰胺濃度(%) 分離DNA的范圍(bp) 3.5 1000-2000 5.0 85-500 8.0 60-40012.0 40-200 15.0 25-150 20.0 6-100 聚丙烯酰胺濃度的高低決定凝膠孔隙的大小，濃度越高、孔隙越小、分辨率越高。43聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)： 比瓊脂糖凝膠的分辨率高得多。0.3-2%瓊脂糖凝膠電泳分辨率：60,000-100bp；3.5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率：2,000-

11、6bp。44（四）電泳緩沖液Tris-乙酸（TAE） Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE） TAE價(jià)格便宜，但緩沖容量低； TBE與TPE緩沖容量高，分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，易使DNA沉淀。推薦使用45 EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。臨用時(shí)用水稀至0.5TBE（20倍稀釋?zhuān)?0TBE緩沖液的配制： Tris堿 108g 硼酸Boric acid 55g EDTA 9.3g 加H2O至 1L（調(diào)PH為8.0-8.2）46（五）核酸電泳的指示劑與染色劑1、指示劑： 常用溴酚蘭，在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4

12、%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，遷移率分別與1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。47使樣品呈色，便于加樣操作；指示劑與蔗糖、甘油組成加樣緩沖液。增加樣品比重，確保DNA均勻沉入加樣孔；在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，可預(yù)測(cè)DNA電泳的速度和位置。加樣緩沖液的作用：48492、染色劑： 核酸電泳后，需經(jīng)染色才能顯出帶型。溴化乙錠染色法銀染色法50 溴化乙錠(ethidium bromide, EB)能插入到DNA分子的相鄰 堿 基 之 間 ， 并 在300nm波長(zhǎng)的紫外光照射下發(fā)出紅色熒光。 1）溴化乙錠染色法：51 可將EB直接加到凝膠介質(zhì)中（終濃度0.5g/ml

13、）；也可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10-15min。 EB與DNA分子結(jié)合，而不與凝膠結(jié)合，DNA分子吸收EB并發(fā)出熒光。52 瓊脂糖凝膠EB染色后，在紫外光下觀察，可檢測(cè)出50ng的DNA。 在適當(dāng)染色條件下，熒光強(qiáng)度與DNA片段的數(shù)量成正比。532、銀染色法： Ag+可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，用還原劑(如甲醛)使Ag+還原成銀顆粒，可將電泳條帶染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝膠染色。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度比EB高200倍。缺點(diǎn)：銀染色后，DNA不宜回收。聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染結(jié)果銀染10min銀染15min三、核酸分子雜交技術(shù) 1968年，華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的Roy Britten及其同事發(fā)

14、明。目的： 用特異探針鑒定復(fù)雜靶DNA中的同源片段。DNA與DNA雜交：A=T、GC DNA與RNA雜交：A=U、GC依據(jù)：堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性隨溫度逐漸降低，變性的兩條單鏈重新形成互補(bǔ)雙鏈。在高溫下，核酸雙鏈解為兩條單鏈；堿基互補(bǔ)變性：復(fù)性： 利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針(probe)，與待測(cè)樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對(duì)，以判斷有無(wú)互補(bǔ)同源核酸序列的存在。 （一）核酸探針 指一段帶有檢測(cè)標(biāo)記、與目的DNA片段特異互補(bǔ)、已知序列的核酸片段。 探針長(zhǎng)度一般以50-300bp為宜。核酸探針的種類(lèi)： 放射性探針?lè)欠派湫蕴结樃鶕?jù)核酸性質(zhì)不同，分為： RNA

15、探針寡核苷酸探針DNA探針cDNA探針根據(jù)標(biāo)記方法不同，分為： 寡核苷酸探針(oligonucleotide probe)簡(jiǎn)并探針組成的寡核苷酸探針庫(kù)6個(gè)氨基酸連續(xù)序列倒推基因序列人工合成單一已知序列的寡核苷酸探針已知序列人工合成根據(jù)生物體對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的偏愛(ài)性，合成系列探針；簡(jiǎn)并探針的設(shè)計(jì)依據(jù)：參考生物體EST(expressed sequence tag)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行傾向性簡(jiǎn)并序列設(shè)計(jì)。EST：對(duì)一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆，進(jìn)行5端和3端單一次測(cè)序，獲得的cDNA部分序列，代表一個(gè)完整基因的一小部分，平均長(zhǎng)度360120 bp。 寡核酸探針的優(yōu)點(diǎn)：序列短，雜交速度快、特異性強(qiáng)；可在短時(shí)間內(nèi)大

16、量制備；可在合成中進(jìn)行標(biāo)記；可合成單鏈探針，避免雙鏈探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率；可檢測(cè)靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化。 寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則：長(zhǎng)度18-50bp； 分子內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū)； GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGC AG+C含量40-60%；避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)） ；與非靶序列70%以上同源性、或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。641、標(biāo)記物的種類(lèi)： 前者更敏感，但后者保存時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)同位素污染。非放射性：生物素、地高辛、熒光素等。放射性：32P、35S、125I等；（二）核酸探針的標(biāo)記缺刻平移法 隨機(jī)引物延伸法反轉(zhuǎn)

17、錄標(biāo)記法末端標(biāo)記法2、探針標(biāo)記方法：1）放射性同位素標(biāo)記：5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 1）Klenow酶介導(dǎo)的3末端標(biāo)記法：KlenowdNTPs（-32P-dATP）5 G-C-T-G-A-A-T-T A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A T-T-A-A-G-C-T-C 5 末端標(biāo)記法675335AA-32P-ddATPTdT552）TdT介導(dǎo)的3末端標(biāo)記法： 3）T4-PNP介導(dǎo)的5末端標(biāo)記法：5 P3 HOOH 3 P 5 5 HO3 HOOH 3 OH 5 CIPT4-PN

18、P-32P-ATP5 P3 HOOH 3 P 5 692）非放射性同位素標(biāo)記： 酶促反應(yīng)標(biāo)記法化學(xué)修飾標(biāo)記法 將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，再利用酶促反應(yīng)，將標(biāo)記的核苷酸摻入探針中。酶促反應(yīng)標(biāo)記法 1）標(biāo)記物-dUTP的生成；（如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）2）將標(biāo)記物-dUTP作為DNA pol I的底物，摻入DNA分子中。71Bio-11-dUTP：生物素(Biotin) Biotin與dUTP之間連接臂的碳鏈長(zhǎng)度。 11：Bio： 廣泛存在于各種組織中，若樣品本身含內(nèi)源性生物素，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。72Dig-11-dUTP：地高辛(digoxigenin)；Dig：

19、 洋地黃植物的花和葉是Dig在自然界中的唯一來(lái)源，抗Dig抗體不會(huì)與其他生物物質(zhì)結(jié)合，可滿(mǎn)足特異性標(biāo)記的需要。 從洋地黃植物中提取的類(lèi)固醇物質(zhì)。地高辛系統(tǒng)標(biāo)記：DIG-11-dUTPDIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物化學(xué)修飾標(biāo)記法 利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針?lè)肿由系幕鶊F(tuán)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由稀?ABC熒光標(biāo)記：熒光胺Avidin鏈親和素GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烴連接臂ABC：Avidin Biotin Complex ABC顯色酶標(biāo)記：GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烴連接臂顯色酶生色底物顏色產(chǎn)物Avidin鏈親和素AB

20、C：Avidin Biotin Complex （三）核酸分子雜交的分類(lèi) 待測(cè)核酸樣本先結(jié)合到固相支持物（硝硝酸纖維素膜、尼龍膜等）上，再與溶液中的特異性探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。 待測(cè)核酸樣本與特異性探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。液相雜交：固相雜交：液相核酸分子雜交固相核酸分子雜交制備待測(cè)核酸樣品制備核酸探針?lè)蛛x、變性、轉(zhuǎn)印、固定與雜交液預(yù)雜交標(biāo)記漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針檢測(cè)雜交信號(hào)雜交加入標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交：消除膜對(duì)探針的非特異性結(jié)合，降低雜交背景。Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交菌落雜交夾心雜交原位雜交常用固相核酸雜交方法1、Southern印跡雜交 是

21、將DNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。 1975年，由英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的Edwen Southern創(chuàng)建，故稱(chēng)Southern blot。 提取DNA樣本限制酶酶切瓊脂糖凝膠電泳分離NaOH變性DNA轉(zhuǎn)印至膜上預(yù)雜交標(biāo)記探針與之雜交放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)結(jié)果分析。Southern blot的基本過(guò)程：用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。83水稻葉綠體DNA分別用Bgl II(A-C)、BamH I(D-F)、EcoR I(G-I)、Hind III(J-L)消化，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后與32P標(biāo)記的玉米psbA探針Southern雜交，X光底片中

22、顯現(xiàn)陽(yáng)性條帶，表明含玉米psbA基因序列。2、Northern印跡雜交 1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。 方法與Southern blot類(lèi)似，故稱(chēng)Northern印跡雜交（ Northern blot）。 提取RNA樣本RNA變性瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)印至膜上預(yù)雜交標(biāo)記探針與之雜交放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)結(jié)果分析。Northern blotting的基本過(guò)程： 用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。87 3、斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交 （spot/slot blot hybridization）基本過(guò)程：

23、 將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)到膜上，或通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)形狹縫轉(zhuǎn)印至膜上膜變性預(yù)雜交標(biāo)記探針與之雜交放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)結(jié)果分析。DNA樣品使用特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，可使眾多待測(cè)樣品一次同步轉(zhuǎn)印至雜交膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。點(diǎn)樣Probe-32P檢測(cè)AB1 2 3 490簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣本用量少。特異性不高，有一定比例的假陽(yáng)性。優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)：AB固相支持物固相吸附探針標(biāo)記檢測(cè)探針 需兩個(gè)靠近且不重疊的探針，一個(gè)作固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測(cè)探針。4、夾心雜交(sanwich hybridization)優(yōu)點(diǎn)：樣品不需固定，對(duì)粗制樣品即能做出可靠的檢測(cè)。特異性強(qiáng)，只有兩個(gè)探針

24、都雜交時(shí)，才能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)； 93注意： 為避免產(chǎn)生高本底信號(hào)，兩探針必須分別克隆入兩個(gè)非同源載體內(nèi)，如一個(gè)克隆入PUC19，另一克隆入pBR322。5、菌落雜交(colony hybridization)基本過(guò)程： 將菌落從平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上裂解菌落、釋放DNA將DNA烘干固定于膜上標(biāo)記的探針與之雜交放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)與平板上的菌落對(duì)位。 用于從大量菌落中篩選含特異DNA序列的目的重組子。6、原位雜交(in situ hybridization, ISH) 是一種可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測(cè)DNA或RNA的技術(shù)，可對(duì)組織細(xì)胞原位的待測(cè)核酸分子進(jìn)行定性、定量及

25、定位分析。97優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸，可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，更準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。FISH檢測(cè)HER-2基因在乳腺癌組織中的表達(dá)FISH檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的費(fèi)城染色體(22和9號(hào)染色體異位) 是利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種操作技術(shù)。 四、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction, PCR）1、模板: （一）PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成 無(wú)論哪種DNA，都要有較高的純度。 質(zhì)粒 -DNA 染色體DNA大小 較小 較大 非常大 目的基因單拷貝變性 易 較難 難用量 l ng 300-50

26、0 ng可以是DNA或RNA。 mRNA cDNA PCR，稱(chēng)為RT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄RNA作為模板時(shí)，需要：RT-PCR：Reverse Transcription PCR 是根據(jù)模板DNA待擴(kuò)增區(qū)兩端的序列而設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸小片斷，長(zhǎng)度一般為15-30bp，最多不超過(guò)50bp 。 3、引物2、Taq DNA聚合酶引物設(shè)計(jì)的原則：長(zhǎng)度適宜，一般15-30bp；G+C含量40-60；4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布；內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；兩條引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)堿基的互補(bǔ)；3端不應(yīng)有任何修飾；5端可修飾，如32P、生物素、熒光素。上游引物5端： 起始密碼子ATG；注意：下游引物5端： 終止密碼子TAA、T

27、AG或TGA；上、下游引物5端： 限制酶識(shí)別序列及其保護(hù)堿基。1045 GGAATTCCCTATGACCCAG 3 不同限制酶需保護(hù)堿基的數(shù)量不同，如： EcoR I 1 Hind III 3 BamH I 2-3 Pst I 4 保護(hù)堿基數(shù)量不合適，會(huì)影響限制酶酶切。保護(hù)堿基4、dNTPs 終濃度：50mol/L，4種dNTPs濃度應(yīng)相等。注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效.1）不同的酶需不同Mg2+：5、Mg2+：Taq酶：0.5-1.5 mM；pfu酶：2-3 mM； dNTP、引物用量約增加1倍。107EDTA鰲合Mg2+；選擇低濃度TE(10mM Tris, 1mM EDTA)；如擴(kuò)增效

28、率不理想，注意調(diào)整Mg2+濃度！2）外界影響：DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基團(tuán)均可結(jié)合Mg2+。 模板DNA 0.1-2 g 引物 各10-100 pmolTaq酶 2.5 U4種dNTP混合物 各200 mol/LMg2+ 1.5 mmol/LddH2O標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：100 L1、變性溫度： （二）PCR參數(shù)94-95，一般30-45 sec。 模板DNA完全變性對(duì)RCR能否成功至關(guān)重要?？?5加熱3-5min預(yù)變性。1102、退火溫度：Tm：50的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度，為退火溫度的參考依據(jù)。Tm = 4(G+C)+2(A+T)退火溫度介于55-72之間，

29、一般選擇Tm-5； 選擇較高的退火溫度，可減少引物與模板非特異性結(jié)合，提高PCR的特異性。1113、延伸溫度：72，一般40-60sec。 72時(shí)，Taq酶處于最高的活力狀態(tài)，反應(yīng)速率約35-100nt/s。 延伸時(shí)間視擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短而定，如擴(kuò)增1-2kb的PCR產(chǎn)物，延伸1min已足夠。 1124、循環(huán)次數(shù) 取決于模板濃度，一般選擇30次。 分析性PCR一般25-30次，制備性PCR一般30-35次，不超過(guò)40次。 循環(huán)次數(shù)太多會(huì)使非特異性產(chǎn)物增加。113常采用的PCR條件：95 變性 30 sec55 退火 30 sec72 延伸 1 min3 0 - 3 5 cycles72 保溫 10 min95 預(yù)變性 5 min4 終 止 forever五、DNA序列分析技術(shù)目前用于測(cè)序的主要技術(shù)： 雙脫氧鏈末端終止法化學(xué)降解法雙脫氧鏈末端終止法1977年，英國(guó)劍橋大學(xué)Frederick Sanger發(fā)明。1）在單鏈模板、引物、4種dNTPs存在時(shí)，Klenow酶能不斷地將dNTP加到引物3-OH末端，合成出與單鏈模板互補(bǔ)的新鏈?；驹恚?）Klenow酶還