農(nóng)用微生物菌劑GB20287-

1、農(nóng)用微生物菌劑（GB 20287-2006）之老陽三干創(chuàng)作創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日刖百本尺度的5.1、5.3和第8章條文為強(qiáng)制性條款，其余為推薦 性條款。本尺度的附錄A、附錄C和附錄D為規(guī)范性附錄，附錄 B為資 料性附錄。農(nóng)用微生物菌劑1范圍本尺度規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑（即微生物接種劑）的術(shù)語和定 義、產(chǎn)品分類、要求、試驗方法、檢驗規(guī)則、包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸 和貯存。本尺度適用于農(nóng)用微生物菌劑類產(chǎn)品。2規(guī)范性引用文件（略）3術(shù)語和定義（略）4產(chǎn)品分類產(chǎn)品按劑型可分為液體、粉劑、顆粒型；按內(nèi)含的微生物種類 或功能特性可分為根瘤菌菌劑、固氮菌菌劑、解磷類微生物菌 劑、硅酸鹽微生物菌劑、光合細(xì)菌菌

2、劑、有機(jī)物料腐熟劑、促生 菌劑、菌根菌劑、生物修復(fù)菌劑等。5 要求5.1 菌種生產(chǎn)用的微生物菌種應(yīng)平安、有效。生產(chǎn)者應(yīng)提供菌種的 分類鑒定陳述，包含屬及種的學(xué)名、形態(tài)、生理生化特性及鑒定 依據(jù)等完整資料。生產(chǎn)者應(yīng)提供菌種平安性評價資料。采取生物 工程菌，應(yīng)具有允許大面積釋放的生物平安性有關(guān)批文。5.2 產(chǎn)品外觀(略)5.3 產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)5.3.1 農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)見表1,其中有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)按表 2執(zhí)行。表1農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)項目齊型液體粉齊1J顆粒后效活困數(shù)(cfu),億 >/g(mL)毒菌雜困數(shù)，個/g(mL)<3.0 1063.0 1063.

3、0 X 106雜菌率，<水分，%<細(xì)度，%>8080pH值保質(zhì)期b,月>36a復(fù)合菌劑，每一種有效菌的數(shù)量不得少于0.01億/g(mL)；以單一的膠質(zhì)芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus )制成的粉劑產(chǎn)品中有效活菌數(shù)很多于1.2億/g。b此項僅在監(jiān)督部分或仲裁雙方認(rèn)為有需要時檢測。表2有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)項目齊型液體粉齊1J顆粒后效活困數(shù)（cfu）,億 >/g（mL）纖維素酶活，U/g （mD >蛋白酶活b, U/g（mL）>水分，%<-細(xì)度，%>-7070pH值保質(zhì)期1月>36a以農(nóng)作物秸稈類為腐熟對象測定

4、纖維素酶活。b以畜禽糞便類為腐熟對象測定蛋白酶活。c此項僅在監(jiān)督部分或仲裁雙方認(rèn)為有需要時檢測。5.3.2 農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品中無害化指標(biāo)見表3表3農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的無害化技術(shù)指標(biāo)參數(shù)尺度極限糞大腸菌群數(shù),個 /g（mL）100蛔蟲卵死亡率，%>95種及其化合物（以As 計），mg/kg75鎘及其化合物（以Cd 計）,mg/kg10鉛及其化合物（以Pb 計），mg/kg100銘及其化合物（以Cr 計），mg/kg150汞及其化合物（以Hg 計），mg/kg56試驗方法6.1 儀器設(shè)備（略）6.2 試劑（略）6.3 產(chǎn)品參數(shù)的檢測6.3.1 外觀（感官）的測定取少量樣品放到白色搪瓷盤（或

5、白色塑料調(diào)色板）中，仔細(xì)觀察 樣品的顏色、形狀、質(zhì)地。6.3.2 有效活菌數(shù)的測定采取平板計數(shù)法，根據(jù)所測微生物的種類選用適宜的培養(yǎng)基。若采取最大可能數(shù)（Most Probable Number , MPN 5管法， 遵照附錄C的規(guī)定。6.3.2.1 系列稀釋稱取樣品10 g （精確到0.01 g ）,加入帶玻璃珠的100 mL的 無菌水中（液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無菌水中），靜置20 min ,在旋轉(zhuǎn)式搖床上 200 r/min充分振蕩30 min ,即成母液菌 懸液（基礎(chǔ)液）。用無菌移液管分別吸取 5.0mL上述母液菌懸液加入 45 mL無菌 水中，按1:10進(jìn)行系列稀釋，

6、分別得到 1:1 X101, 1:1 X102, 1:1 X 103, 1:1 X 104稀釋的菌懸液（每個稀釋度應(yīng)更換無菌移 液管）。6.3.2.2 加樣及培養(yǎng)每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，用無菌移液管分別吸取分 歧稀釋度菌懸液0.1 mL ,加至預(yù)先制備好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將分歧稀釋度的菌懸液均勻地涂于瓊脂概 況。每一稀釋度重復(fù)3次，同時以無菌水作空白對照，于適宜的條 件下培養(yǎng)。6.3.2.3 菌落識別根據(jù)所檢測菌種的技術(shù)資料，每個稀釋度取分歧類型的代表菌 落通過涂片、染色、鏡檢等技術(shù)手段確認(rèn)有效菌。當(dāng)空白對照培 養(yǎng)皿出現(xiàn)菌落數(shù)時，檢測結(jié)果無效，應(yīng)重做。6.3.2.4

7、 菌落計數(shù)以出現(xiàn)20300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)尺度(絲狀真 菌為10150個菌落數(shù))，分別統(tǒng)計有效活菌數(shù)目和雜菌數(shù)目。當(dāng) 只有一個稀釋度，其平均菌落數(shù)在20300個之間時，則以該平均菌落數(shù)計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20300個之間時，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定。若其比值小于等于2應(yīng)計算兩者的平均數(shù)；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計算。有效活菌數(shù)按式(1)或式(2)計算：nm= Hkv i/( mv2)x 10- 8(1)nv = Elkv1/( V0V2) x 10- 8(2)式中：nm 質(zhì)量有效活菌數(shù)，nv 一體積有效活菌數(shù)，億/mL©一菌落平均數(shù)，個k 一稀

8、釋倍數(shù)vi 一基礎(chǔ)液體積，V2 一菌懸液加入量，Vo 一樣品量，mLmo 一樣品量，g6.3.3 霉菌雜菌數(shù)的測定采取馬丁培養(yǎng)基，測定方法同6.3.2 。6.3.4 雜菌率的測定億/gmLmL除樣品有效菌外其它的菌均為雜菌。樣品中雜菌率按式( 計算：3)ni/( ni+n) 乂 100(3)式中：m 一樣品雜國率，ni 雜困數(shù)，億/g（mL）n 一有效活菌數(shù)，億/g（mL）6.3.5水分的測定將空鋁盒置于干燥箱中 105 C±2 C烘干0.5 h ,冷卻后稱 量記錄空鋁盒的質(zhì)量。然后稱取2份平行樣品（顆粒型樣品，應(yīng)先粉碎過1.0 mm試驗篩），每份 20 g （精確到0.01 g ）

9、,分別 加入鋁盒中并記錄質(zhì)量。將裝好樣品的鋁盒置于干燥箱中105 C±2 C下烘干4 h6 h。取出置于干燥器中冷卻 20 min后進(jìn)行稱 量。水分含量按式（4）計算（結(jié)果為兩次測定的平均值）：w = （ m- mb）/（ m1- m0） X100（4）式中：w 一樣品水分含量，%m一空鋁盒的質(zhì)量，gm一樣品和鋁盒的質(zhì)量，gm2 一烘干后樣品和鋁盒的質(zhì)量，g6.3.6細(xì)度的測定6.3.6.1 粉劑樣品稱取樣品50 g （精確到0.1 g ）,放入300 mL燒杯中，力口200 mL水浸泡10 min30 min后倒入孔徑0.18 mm的試驗篩中, 創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日然后

10、用水沖洗，并用刷子輕輕地刷篩面上的樣品，直至篩下流出 清水為止。將試驗篩連同篩上樣品放入干燥箱中，在 105 c ±2 C烘干4 h 6 h。冷卻后稱量篩上樣品質(zhì)量。樣品細(xì)度按式(5)計算：s =1- mi/ mo (1-w) X100(5)式中：s 一篩下樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%mo 一樣品質(zhì)量，gw 一樣品含水量，%m 一篩上干樣品質(zhì)量，g6.3.6.2顆粒樣品稱取樣品50 g (精確到0.1 g ),將兩個分歧孔徑的試驗篩(1.0 mm和4.75 mm)摞在一起放在底盤上(大孔徑試驗篩放在上 面)。樣品倒入大孔徑試驗篩內(nèi)篩樣品，然后稱小孔徑試驗篩上的 樣品質(zhì)量。顆粒細(xì)度按式(6)計算：

11、g = m / ro X100(6)式中：g 一樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%m 一小孔徑試驗篩上樣品質(zhì)量，gmo 一樣品質(zhì)量，g6.3.7 pH值的測定打開酸度計電源預(yù)熱30 min ,用尺度溶液校準(zhǔn)。pH值的測定，每個樣品重復(fù)三次，計算三次的平均值。6.3.7.1 液體樣品用量筒取40mL樣品放入50 mL的燒杯中，直接用酸度計測 定，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。6.3.7.2 粉劑樣品稱取樣品15 g ,放入50 mL的燒杯中，按1:2（樣品：無離子水） 的比例將無離子水加到燒杯中（如果樣品含水量低，可根據(jù)基質(zhì)類 型按1:31:5的比例加無離子水），攪拌均勻。然后靜置 30 min,測樣品懸液的pH值，儀器讀

12、數(shù)穩(wěn)定后記錄。6.3.7.3 顆粒樣品樣品先研碎過1.0 mm試驗篩，依照6.3.7.2的方法測定。6.3.8 糞大腸菌群數(shù)的測定應(yīng)符合GB/T 19524.1肥料中糞大腸菌群的測定的規(guī)定。6.3.9 蛔蟲卵死亡率的測定應(yīng)符合GB/T 19524.2肥料中蛔蟲卵死亡率的測定的規(guī) 定。6.3.10 纖維素酶活、蛋白酶活的測定應(yīng)符合附錄D的規(guī)定。6.3.11 碑、鎘、鉛、銘、汞的測定應(yīng)符合 GB 18877 2002中的5.125.17 的規(guī)定。6.3.12 保質(zhì)期的檢驗在產(chǎn)品說明書標(biāo)明的保質(zhì)期前，按6.3.16.3.11方法測定產(chǎn)品相應(yīng)指標(biāo)。7檢驗規(guī)則本尺度中產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)的數(shù)字修約應(yīng)符合GB 8

13、170的規(guī)定；產(chǎn)品質(zhì)量合格判定應(yīng)符合 GB 1250中修約值比較法的規(guī)定。7.1 抽樣按每一發(fā)酵罐菌液（或每批固體發(fā)酵）加工成的產(chǎn)品為一批， 進(jìn)行抽樣檢驗，抽樣過程嚴(yán)格防止雜菌污染。7.1.1 抽樣工具無菌塑料袋（瓶），金屬勺、抽樣器、量筒、牛皮紙袋、膠水、 抽樣封條及抽樣單等。7.1.2 抽樣方法和數(shù)量一般在成品庫中抽樣，采取隨機(jī)法抽取。抽樣以件為單位，小包裝以每一包裝箱為一件。隨機(jī)抽取35件，每件中隨機(jī)抽取一袋（瓶）；若每袋（瓶）包裝小于500 g（mD的產(chǎn)品，應(yīng)多抽幾件。大包裝產(chǎn)品以一袋（桶）為一件，隨機(jī)抽取510件，在無菌條件下，每件取樣500 g（mL）,然后將抽取樣品混勻，按四分法

14、分裝3袋（瓶），每袋（瓶）很多于 500g（mL）。7.2 檢驗分類（略）7.3 判定規(guī)則7.3.1 具下列任何一條款者，均為合格產(chǎn)品a.檢驗結(jié)果各項技術(shù)指標(biāo)均符合尺度要求的產(chǎn)品；b.在產(chǎn)品的外觀、水分、細(xì)度、pH值等檢測項目中，有 1項不符合要求，而其它各項技術(shù)指標(biāo)符合要求的產(chǎn)品。7.3.2 具下列任何一條款者，均為分歧格產(chǎn)品a.有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)；b.霉菌雜菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)；c.雜菌率不符合技術(shù)指標(biāo)；d.糞大腸菌群不符合技術(shù)指標(biāo)；e.蛔蟲卵死亡率不符合技術(shù)指標(biāo)；f.碑、鎘、鉛、銘、汞中任一含量不符合技術(shù)指標(biāo)；g.有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品中所測酶活不符合技術(shù)指標(biāo)；h.在外觀、水分、細(xì)度、p

15、H值等檢測項目中，有 2項（含） 以上不符合要求。8包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存拜見NY 885-2004農(nóng)用微生物產(chǎn)品標(biāo)識要求附錄 A經(jīng)常使用檢測培養(yǎng)基拜見NY/T 1114-2004微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術(shù)條 件(資料性附錄)經(jīng)常使用染色劑8.1 革蘭氏染色劑8.1.1 結(jié)晶紫染色液(Hucker氏配方)甲液：結(jié)晶紫(Crystal violet )2.0 g乙醇(95%)20.0 mL乙液：草酸鏤(NH4)2QO?Hb蒸儲水80.0 mL甲、乙兩液相混，過濾，棕色瓶保管。8.1.2 盧哥(Lugol)氏碘液碘(I 2)片1.0 g碘化鉀(KI)2.0 g蒸儲水300 mL先溶碘化鉀于少量蒸儲

16、水中，再將碘溶于碘化鉀溶液中，可稍加熱，最后加足蒸儲水，棕色瓶保管。8.1.3 脫色液95%的乙醇液。8.1.4 復(fù)染液0.5%的番紅水溶液(Safranin O)2.5%的番紅酒精溶液20 mL蒸儲水80 mLB.2 芽胞染色液8.2.1 孔雀綠染色液(Malachite green )孔雀綠5.0 g蒸儲水100 mLB.2.20.5%番紅染色液B.3 石碳酸復(fù)紅染色液甲液：堿性復(fù)紅(Basic fuchsin)0.3 g95%酉精10.0 mL乙液：石碳酸(Phenoecrystals C.P) 5.0 g蒸儲水95 mL將甲、乙兩液混合后即得石碳酸復(fù)紅染色液原液。染色時， 將原液稀釋5

17、10倍使用。附錄C（規(guī)范性附錄）稀釋法（MPN 5管法）C.1 稀釋稱取樣品10.0 g ,加入帶玻璃珠的100 mL的無菌水中（液體 菌劑取10.0 mL加入90 mL的無菌水中），靜置20 min ,在旋轉(zhuǎn) 式搖床上200 r/min 充分振蕩30 min,即得到1X101稀釋度的菌 懸液。用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有 45mL無菌水 的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到 1X102稀釋度的菌懸液，依此 方法制成1X103、1X104、1X105稀釋度的菌懸液（每個稀釋 度應(yīng)更換無菌移液管）。C.2 加樣選擇適宜的5個連續(xù)稀釋度，用無菌移液管分別吸取分歧稀釋 度的菌懸液1.0

18、mL,加到已準(zhǔn)備好的盛有 9.0 mL無菌培養(yǎng)基的 螺口試管中，每一稀釋度重復(fù)接5支試管（分歧稀釋度間更換無菌移液管），同時用無菌培養(yǎng)液作對照。C.3 培養(yǎng)接種后立即擰緊塑料帽并搖勻，將接種好的試管放到適宜的條 件下培養(yǎng)。C.4 計算根據(jù)各稀釋系列試管中有無待測微生物生長或其生理反應(yīng)的正 或負(fù)得出數(shù)量指標(biāo)，并在相應(yīng)的MP儂計表中查出近似值（見表C1）,即可計算出待測樣品的有效活菌數(shù)，以億個 /mL或億個/g 暗木。計算方法：1mL （g）樣品中的有效活菌數(shù)=菌數(shù)近似值x數(shù)量指標(biāo) 第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)C.5 計數(shù)規(guī)則在稀釋系列中必須最后一個稀釋度所有重復(fù)間都沒有微生物生 長。確定數(shù)量指標(biāo)系取稀釋系列中所有重復(fù)都有生長（或是正反應(yīng)）的最高稀釋度為數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)字，總共取三個連續(xù)