分子生物學(xué)常用技術(shù)簡化版

1、同 位 素半 衰 期比 活 性用 途特 點32P14. 3 天9120DNA放 射 性 強35S87. 1 天1490DNA/ 蛋 白3H12. 1 年29DNA/ 蛋 白分 辨 率 高125I60 天2400蛋 白標(biāo) 記 簡 單標(biāo) 記 方 法標(biāo) 記 物探 針缺 口 平 移同 位 素 或 半 抗 原D N A 探 針隨 機 引 物 標(biāo) 記同 位 素 或 半 抗 原D N A 探 針5或3末 端 標(biāo) 記同 位 素寡 核 苷 酸 探 針P C R標(biāo) 記同 位 素 或 半 抗 原D N A 探 針體 外 轉(zhuǎn) 錄同 位 素 或 半 抗 原單 鏈 R N A 探 針化 學(xué) 標(biāo) 記半 抗 原均 可轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜

2、DNADNA的體內(nèi)復(fù)制的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNADNA解旋解解旋解鏈鏈ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA解旋解解旋解鏈鏈引物合引物合成成DNADNA的體內(nèi)復(fù)制的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTA

3、TCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解旋解鏈解鏈引物合引物合成成新鏈延伸新鏈延伸DNA的體內(nèi)復(fù)制的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35變性復(fù)性加熱退火DNA加熱解鏈模板DNA9455引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第1輪結(jié)束94第2輪開始72TaqTaqTaqTaq55第2輪結(jié)束重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2

4、n n 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性新鏈延伸DNA的體外擴增的體外擴增熱循環(huán)DNA解鏈PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200 mol/L引物 各0.1-0.5 mol/L模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶 2.5 UMg2+ 1.5mmol/LDNA的體外擴增的體外擴增DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)dNTP53分類分類Western BlotWestern Blot

5、顯色的方法主要有以下幾種：顯色的方法主要有以下幾種：i. i. 放射自顯影放射自顯影ii. ii. 底物化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光ECLECLiii. iii. 底物熒光底物熒光ECFECFiv. iv. 底物底物DABDAB呈色呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECLECL和底物和底物DABDAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECLECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRPHRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過