核酸特性鑒定和遺傳穩(wěn)定性

1、.天馬行空官方博客： ；QQ:1318241189；QQ群：175569632 核酸特性鑒定和遺傳穩(wěn)定性 （ FDA， 1992年 4月 6日） 用rDNA技術(shù)生產(chǎn)新藥與生物制品的考慮要點(diǎn)的補(bǔ)充 1前言本文是關(guān)于用真核及原核細(xì)胞生產(chǎn)rDNA蛋白產(chǎn)品所用表達(dá)載體的鑒定指南。表達(dá)載體是指含有編碼重組蛋白序列的表達(dá)載體。表達(dá)載體的特性鑒定是用rDNA技術(shù)生產(chǎn)新藥與生物制品考慮要點(diǎn)，1985所注意的問(wèn)題之一。自那以后，蛋白分析技術(shù)和核酸特性鑒定與發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)工藝平行地取得了進(jìn)展。本文的意圖是推廣和闡明那些對(duì)確定生產(chǎn)rDNA蛋白用表達(dá)載體結(jié)構(gòu)有價(jià)值的信息。在制定該文中，我們考慮了生物化學(xué)技術(shù)的新進(jìn)展、

2、不同生產(chǎn)系統(tǒng)的既往歷史、來(lái)自國(guó)際會(huì)議的信息、以及提交給FDA的意見(jiàn)。特別是1991年召開的國(guó)際傳代細(xì)胞一當(dāng)前問(wèn)題討論會(huì)對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行的詳細(xì)討論。CBER科學(xué)專家們確信，本文提出的補(bǔ)充指南反映了科學(xué)界的一般見(jiàn)解，并闡明了鑒定核酸的特性和確定遺傳穩(wěn)定性需要進(jìn)行的試驗(yàn)。CBER認(rèn)識(shí)到，這是工業(yè)界特別關(guān)注的領(lǐng)域之一，對(duì)本文提出的意見(jiàn)在以后修訂用rDNA技術(shù)生產(chǎn)新藥與生物制品的考慮要點(diǎn)中將予以考慮。 表達(dá)載體核酸特性鑒定的理論基礎(chǔ)重組蛋白是在活細(xì)胞中產(chǎn)生的，活細(xì)胞會(huì)突變，從而會(huì)改變某一蛋白的性質(zhì)，使其對(duì)人具有潛在不良影響。沒(méi)有任何簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方法可以檢出某一蛋白所有可能變易。蛋白分析技術(shù)可用于確定表達(dá)蛋白

3、的許多結(jié)構(gòu)特征，以及由于轉(zhuǎn)譯后修飾系統(tǒng)，諸如影響蛋白水解加工、糖基化、磷酸化、乙酰化及蛋白其他變易（如脫酰胺基，氧化）造成的一些改變。但是，分析最終的純化蛋白可能檢查不出來(lái)由于編碼蛋白序列突變導(dǎo)致某一蛋白結(jié)構(gòu)的所有變易。例如保守氨基酸的置換可能被肽圖技術(shù)漏檢，并仍可引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變。某些改變可能不影響體外活性，但是，可引起明顯的體內(nèi)的效應(yīng)，如導(dǎo)致藥效學(xué)、藥物動(dòng)力或誘生抗體應(yīng)答方面的改變。在大量產(chǎn)生外源蛋白的某一細(xì)胞群體中，產(chǎn)生某一變易蛋白或產(chǎn)生蛋白量減少的突變細(xì)胞可能具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，于是，經(jīng)許多代后，細(xì)胞群體中的這類細(xì)胞增多。在鑒定最終純化蛋白時(shí)，可能漏掉已合成但又被下游工藝去除的變易蛋白。在

4、純化步驟的效能發(fā)生故障時(shí)，這些變易蛋白可能污染最終的純化蛋白，盡管在理論上可在DNA或RNA水平上檢出編碼蛋白基因的突變。因此，應(yīng)仔細(xì)選用包括純化蛋白及核酸二者都能分析的綜合方法，以確保產(chǎn)品的連續(xù)一致性。用分析生物化學(xué)技術(shù)分析純化蛋白的數(shù)據(jù)比較容易解釋，并在用rDNA技術(shù)生產(chǎn)新藥與生物制品的考慮要點(diǎn)，1985中討論過(guò)。在某些情況下，從最終產(chǎn)品的角度很難解釋核酸試驗(yàn)結(jié)果。但是，將此類數(shù)據(jù)作為純化蛋白分析數(shù)據(jù)的補(bǔ)充。可提供有價(jià)值的信息。可用核酸分析驗(yàn)證編碼蛋白的序列及表達(dá)載體的物理狀態(tài)。驗(yàn)證編碼序列不是為了檢測(cè)低水平的變易序列，而是驗(yàn)證細(xì)胞經(jīng)全規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程操作后，純化之前，占優(yōu)勢(shì)的蛋白種類具有正確

5、的氨基酸序列。當(dāng)生產(chǎn)細(xì)胞的表達(dá)載體有多個(gè)整合考貝時(shí)，可能不是所有考貝都有轉(zhuǎn)錄活性，用mRNA或cDNA分析檢查轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物本身，可能比分析DNA基因組更為適宜。如用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的材料檢查大量群體的核酸，可能比用取決于個(gè)別DNA克隆選擇的方法更為可取。應(yīng)提供下述各節(jié)敘述的，在開發(fā)和驗(yàn)證生產(chǎn)用細(xì)胞克隆過(guò)程中鑒定表達(dá)載體的資料。這些建議是基于目前的技術(shù)提出的，可以預(yù)見(jiàn)，隨著該領(lǐng)域新技術(shù)的發(fā)展和我們認(rèn)識(shí)的提高，將會(huì)對(duì)其進(jìn)行修訂。表達(dá)載體的特性鑒定 A初始細(xì)胞克隆 DNA克隆生產(chǎn)者應(yīng)說(shuō)明編碼蛋白DNA的制備方法，包括細(xì)胞及原料核酸的來(lái)源。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明表達(dá)載體的組建步驟，應(yīng)包括表達(dá)載體組件的來(lái)源和功能，例如

6、，復(fù)制的由來(lái)，抗生素抗性基因，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，合成的蛋白是否是融合蛋白。應(yīng)提供限制性核酸內(nèi)切酶消化圖譜，說(shuō)明構(gòu)建表達(dá)載體所用的位點(diǎn)，以及鑒別DNA片段所用的位點(diǎn)。應(yīng)進(jìn)行表達(dá)載體編碼蛋白區(qū)的全氨基酸序列分析，應(yīng)提供序列分析結(jié)果，包括所有標(biāo)明的重要序列特征的完整評(píng)注。例如，與構(gòu)建有關(guān)的位點(diǎn)，不同于原序列的改變。若編碼蛋白區(qū)含有編碼序列以外的信息，如內(nèi)含子或側(cè)翼序列，則應(yīng)對(duì)這些附加序列進(jìn)行特性鑒定。 細(xì)胞表達(dá)克隆預(yù)定產(chǎn)生蛋白的宿主細(xì)胞系統(tǒng)應(yīng)與表達(dá)載體相容。為此，提供有關(guān)細(xì)胞來(lái)源、表型及基因型的說(shuō)明很重要。宿主細(xì)胞應(yīng)按生物制品生產(chǎn)用傳代細(xì)胞鑒定的考慮要點(diǎn)，1987充分進(jìn)行鑒定，應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體導(dǎo)入宿

7、生細(xì)胞方法的說(shuō)明。另外，應(yīng)全面說(shuō)明擴(kuò)增表達(dá)載體及選擇生產(chǎn)用細(xì)胞克隆所用的方法和標(biāo)準(zhǔn)。表達(dá)載體的考貝數(shù)及物理狀態(tài)亦應(yīng)確定。 B基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)（MCB），是等量分裝后在規(guī)定條件下保存的一批組成均一的細(xì)胞，用其制備所有的次級(jí)細(xì)胞庫(kù)（按生物制品生產(chǎn)用傳代細(xì)胞鑒定的考慮要點(diǎn)，1987所述）。MCB一般是由含有表達(dá)載體的單個(gè)宿主細(xì)胞克隆建立的。應(yīng)說(shuō)明克隆經(jīng)過(guò)，包括有關(guān)建立MCB及方法學(xué)資料。若采用將表達(dá)載體導(dǎo)人宿主細(xì)胞，隨后進(jìn)行克隆篩選的方法建立新的細(xì)胞庫(kù)，應(yīng)說(shuō)明新克隆及所產(chǎn)生蛋白的合格標(biāo)準(zhǔn)。每一MCB細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)表型標(biāo)記檢查，例如，營(yíng)養(yǎng)缺陷及抗生素抗性，以確保其同一性和純度。每一MCB應(yīng)進(jìn)行外源

8、因子檢查，基適宜，按生物制品生產(chǎn)用傳代細(xì)胞鑒定的考慮要點(diǎn)，1987進(jìn)行。MCB應(yīng)定期進(jìn)行特性鑒定，以確保其活力。 每一MCB最少要測(cè)定一次表達(dá)載體的完整性。應(yīng)驗(yàn)證編碼蛋白的核苷酸序列。帶有編碼蛋白基因單基因組考貝的細(xì)胞，測(cè)定總基因組DNA序列可能比測(cè)定單基因組序列更為可取。帶有多染色體插入表達(dá)載體的細(xì)胞應(yīng)用mRNA或cDNA直接序列測(cè)定法測(cè)定編碼產(chǎn)物校酸序列。對(duì)于染色體外表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)分離表達(dá)載體，在不進(jìn)一步克隆的情況下驗(yàn)證編碼產(chǎn)物核苷酸序列。MCB細(xì)胞的表達(dá)載體應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶圖譜法分析考貝數(shù)，大的插入段及缺失段，以及整合位點(diǎn)數(shù)目（帶有多染色體整合的細(xì)胞）。對(duì)于染色體外表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)在有選擇及

9、無(wú)選擇的培育條件下測(cè)定宿主保留表達(dá)載體的百分比。上述檢定亦適用于新建的MCB。 C生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（ MWCB）MWCB是按生物制品生產(chǎn)用傳代細(xì)胞鑒定的考慮要點(diǎn)，1987）由1安瓶或以上MCB細(xì)胞擴(kuò)增建立的。每一MWCB是等量分裝后在規(guī)定條件下保存的一批組成均一的細(xì)胞。應(yīng)詳細(xì)敘述MWCB的制備，包括培育過(guò)程中所用的方法和試劑，由MWCB算起的群體倍增數(shù)，以及保存條件。在保存期間，應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶圖譜確定表達(dá)載體考貝數(shù)及插入段或缺失段的方法鑒定MWCB的同一性。另外，必要時(shí)，應(yīng)用表型鑒定法，例如，營(yíng)養(yǎng)缺陷，抗生素抗性鑒別MWCB。 D生產(chǎn)終末的細(xì)胞生產(chǎn)終未的細(xì)胞是由MWCB擴(kuò)增的按全規(guī)模生產(chǎn)條件在一次實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中結(jié)束時(shí)取得的細(xì)胞。每一MWCB應(yīng)按本文 項(xiàng)規(guī)定鑒定一次生產(chǎn)終未細(xì)胞表達(dá)載體的完整性。全規(guī)模生產(chǎn)設(shè)施的生產(chǎn)終末細(xì)胞應(yīng)重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)規(guī)模設(shè)施的生產(chǎn)終末細(xì)胞所進(jìn)行的鑒定。重要的是應(yīng)說(shuō)明，上述對(duì)生產(chǎn)終末細(xì)胞進(jìn)行的鑒定，不是指每一次生產(chǎn)過(guò)程結(jié)束時(shí)都要進(jìn)行。在每一生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)進(jìn)行有關(guān)細(xì)胞表型或基因型標(biāo)記分析，并按生物制品生產(chǎn)用傳代細(xì)胞鑒定的考慮要