內毒素檢測進展

1、1 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院檢驗科細菌第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院檢驗科細菌室室樊樊 新新內毒素檢測進展及臨床意義2 內毒素（內毒素（Endotoxin, ET）是革蘭氏陰）是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，其化學成分為脂性細菌細胞壁的主要成分，其化學成分為脂多糖（多糖（Lipopolysaccharide，LPS），由類脂），由類脂A、核心寡聚糖、核心寡聚糖O及多糖側鏈組成。及多糖側鏈組成。3一、內毒素的產生，作用機理及一、內毒素的產生，作用機理及生物學效應生物學效應u內毒素的產生內毒素的產生 以往認為以往認為ET作為細胞壁的結構成分只有在菌體作為細胞壁的結構成分只有在菌體死亡或人工裂解時才能釋放出來。

2、但近年來發(fā)現(xiàn)死亡或人工裂解時才能釋放出來。但近年來發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性桿菌在細菌對數(shù)生長期或細菌營養(yǎng)缺革蘭氏陰性桿菌在細菌對數(shù)生長期或細菌營養(yǎng)缺乏時也可以以乏時也可以以“出皰疹出皰疹”的方式被釋放的方式被釋放ET。4 u ET的入血途徑的入血途徑 l腸道內毒素的吸收腸道內毒素的吸收l敗血癥時血中細菌的釋放敗血癥時血中細菌的釋放 l外源性輸入外源性輸入 5u內毒素的作用機理內毒素的作用機理LPSLPS-LBP（LPS結合蛋白）結合蛋白）LPS-SCO14（細胞膜上的受體）（細胞膜上的受體）信號傳遞信號傳遞信號傳遞信號傳遞CD14+細胞細胞（M，PMN，單核核細胞），單核核細胞）CD14細胞細胞（上皮細

3、胞等）（上皮細胞等）吞噬作用吞噬作用殺菌活性殺菌活性一級介質釋放一級介質釋放粘附分子表達粘附分子表達細胞反應細胞反應6TNF、IL-1IL-6、IL-8瀑布樣反應，全身炎性反應綜合癥瀑布樣反應，全身炎性反應綜合癥急性炎癥急性炎癥PG、TXA、LTC、PAG、C5a、O2-、NO，彈力酶，彈力酶（二級介質）（二級介質）膿毒綜合征膿毒綜合征（發(fā)熱、低溫、心動過速、尿少、酸中毒、低血壓）（發(fā)熱、低溫、心動過速、尿少、酸中毒、低血壓）DIC內毒素休克內毒素休克MOSF（多器官功能衰竭）（多器官功能衰竭）死亡死亡7內毒素的生物學效應內毒素的生物學效應l發(fā)熱反應發(fā)熱反應l白細胞反應白細胞反應l內毒素血癥（

4、內毒素血癥（ETM）與內毒素休克（）與內毒素休克（ETS）l彌漫性血管內凝血（彌漫性血管內凝血（DIC） 8二、內毒素的檢測二、內毒素的檢測目前內毒素檢測的方法主要有：目前內毒素檢測的方法主要有： 鱟試驗鱟試驗 ELISA法法 結合免疫鱟試驗法（結合免疫鱟試驗法（IML） 自動化動力學方法自動化動力學方法 化學發(fā)光法化學發(fā)光法 光纖維生物傳感法光纖維生物傳感法 毛細管電泳法毛細管電泳法9鱟試驗鱟試驗 鱟試驗（鱟試驗（LT）檢測）檢測LPS機理是機理是LPS通過激活通過激活C、B因子、前凝固酶而使可凝蛋白變成凝固蛋白，形成因子、前凝固酶而使可凝蛋白變成凝固蛋白，形成肉眼可見的膠凍狀物，通過比濁，

5、對肉眼可見的膠凍狀物，通過比濁，對LPS進行半定進行半定量或定量檢測。該法簡單、無需特殊設備、耗費少、量或定量檢測。該法簡單、無需特殊設備、耗費少、敏感性較好，可檢測出敏感性較好，可檢測出0.011ng/ml的的LPS，但易受，但易受多種因素的影響。多種因素的影響。10 標本顏色的深淺可使敏感性偏低；標本顏色的深淺可使敏感性偏低；受血漿中受血漿中LPS抑制因子的干擾；抑制因子的干擾；非特異性凝血酶、凝血活非特異性凝血酶、凝血活酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鱟變形細胞溶酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鱟變形細胞溶解物產生假陽性反應；解物產生假陽性反應；LT法的標準化問題（目前法的標準化問題（目

6、前國際尚無統(tǒng)一標準）。國際尚無統(tǒng)一標準）。11 ELISA法法 利用多粘菌素利用多粘菌素B L聚組氨酸及廣譜交叉反應聚組氨酸及廣譜交叉反應性的抗性的抗LPSMcAb與與LPS有廣泛的結合能力的特點，有廣泛的結合能力的特點，用其包被微量反應板，加入待檢樣品，再加抗用其包被微量反應板，加入待檢樣品，再加抗LPS單克隆抗體（單克隆抗體（McAb），通過酶標二抗的顯示來定），通過酶標二抗的顯示來定量測定量測定LPS，該法敏感性不高（，該法敏感性不高（0.5ng/ml），與），與LT法的相當法的相當,但定量準確性高于但定量準確性高于LT法。法。12結合免疫鱟試驗法（結合免疫鱟試驗法（Immunolimu

7、lus, IML） 以廣泛交叉反應性抗以廣泛交叉反應性抗LPSMcAb（Wn1222-5）來捕獲來捕獲LPS，再與鱟試劑反應再與鱟試劑反應，可定量檢測樣本中可定量檢測樣本中腸桿菌科細菌感染所釋放的腸桿菌科細菌感染所釋放的LPS，敏感性可達，敏感性可達100pg/ml。該法以抗。該法以抗LPS單克隆抗體為探針使內毒單克隆抗體為探針使內毒素血癥檢測特異性得以改善，且不受標本濁度、放素血癥檢測特異性得以改善，且不受標本濁度、放置時間、抑制因子等非特異性因素的影響，但仍不置時間、抑制因子等非特異性因素的影響，但仍不能避免鱟試劑自身因素的影響。能避免鱟試劑自身因素的影響。13自動化動力學方法自動化動力學

8、方法 該方法先用該方法先用KOH的復合堿試劑在微量反應板上對的復合堿試劑在微量反應板上對血漿標本進行預處理，以去除或滅活其中的干擾因血漿標本進行預處理，以去除或滅活其中的干擾因子及酶抑制物，再直接加入對子及酶抑制物，再直接加入對LPS高度特異的產色高度特異的產色鱟試劑（鱟試劑（Endospecy），隨后啟動動態(tài)顯色測定程），隨后啟動動態(tài)顯色測定程序，檢測儀自動繪制序，檢測儀自動繪制30min內的各孔反應曲線，根內的各孔反應曲線，根據(jù)標準曲線計算出樣本中的據(jù)標準曲線計算出樣本中的LPS濃度。濃度。 14 該方法對該方法對LPS的定量范圍為的定量范圍為10100pg/ml。反應中。反應中所用產色鱟

9、試劑不含所用產色鱟試劑不含G因子，因此可避免與標本中因子，因此可避免與標本中存在的真菌發(fā)生凝固作用而出現(xiàn)非特異性反應，其存在的真菌發(fā)生凝固作用而出現(xiàn)非特異性反應，其優(yōu)點還體現(xiàn)在標本先用堿處理，從而克服了鱟試劑優(yōu)點還體現(xiàn)在標本先用堿處理，從而克服了鱟試劑內的一些影響因素。內的一些影響因素。15化學發(fā)光法化學發(fā)光法 利用利用CR1和和CR3受體誘導中性多核粒細胞中的氧受體誘導中性多核粒細胞中的氧化產物作為檢測平臺，依靠化產物作為檢測平臺，依靠LPSLPS抗體復合物抗體復合物使全血中的中性粒細胞所釋放的氧化物質，引起補使全血中的中性粒細胞所釋放的氧化物質，引起補體調理酵母多糖，導致發(fā)光物質（體調理酵

10、母多糖，導致發(fā)光物質（CL）氧化而發(fā)光，）氧化而發(fā)光，通過儀器光學系統(tǒng)檢測發(fā)光的強度而定量測定血中通過儀器光學系統(tǒng)檢測發(fā)光的強度而定量測定血中的內毒素，對的內毒素，對LPS定量范圍為定量范圍為20200pg/ml。該法對。該法對大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌的大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌的LPS有廣泛的反應性，而有廣泛的反應性，而對革蘭氏陽性菌、曲霉菌等無反應，可望成為臨床對革蘭氏陽性菌、曲霉菌等無反應，可望成為臨床診斷內毒素血癥的有用工具。診斷內毒素血癥的有用工具。16光纖維生物傳感法光纖維生物傳感法 利用短波光纖維生物傳感器檢測利用短波光纖維生物傳感器檢測LPS，最低敏感，最低敏感性為性為10ng/ml，可

11、在，可在30s內完成。其原理是共價結合內完成。其原理是共價結合于光纖維探針表面上的多粘菌素于光纖維探針表面上的多粘菌素B可選擇性地結合可選擇性地結合熒光標記的熒光標記的LPS，未標記的，未標記的LPS在競爭試驗中根據(jù)在競爭試驗中根據(jù)已標記的已標記的LPS產生的熒光強度得以定量檢測。此法產生的熒光強度得以定量檢測。此法不僅應用于臨床而且還可應用于環(huán)境中不僅應用于臨床而且還可應用于環(huán)境中LPS的檢測，的檢測，該法雖快速簡便，但敏感性不如該法雖快速簡便，但敏感性不如IML法和法和ELISA法。法。17毛細管電泳法毛細管電泳法 LPS是缺乏有旋光力的基團，檢測其未衍化的狀是缺乏有旋光力的基團，檢測其未

12、衍化的狀態(tài)比較困難。硼酸鹽可與態(tài)比較困難。硼酸鹽可與LPS分子的二乙基結合使分子的二乙基結合使其旋光力增強，采用其旋光力增強，采用UV活性多粘菌素活性多粘菌素B與與LPS形成形成復合物或熒光素異硫基氟酸鹽標記復合物或熒光素異硫基氟酸鹽標記LPS亦可達到目亦可達到目的。方法是將處理過的標本吸入毛細管，用標準磷的。方法是將處理過的標本吸入毛細管，用標準磷酸鹽緩沖液（酸鹽緩沖液（100mg/ml）做電泳，）做電泳，6min內即可完成內即可完成檢測。此法敏感性為檢測。此法敏感性為35pg/ml，但電泳的條件不易，但電泳的條件不易掌握，且易受某些技術因素或固有誤差的影響，目掌握，且易受某些技術因素或固有

13、誤差的影響，目前尚難以推廣應用。前尚難以推廣應用。18MB80內毒素測定系統(tǒng)內毒素測定系統(tǒng)內毒素葡聚糖 19l儀器概述儀器概述 MB80內毒素定量測定系統(tǒng)是專門用于定量測內毒素定量測定系統(tǒng)是專門用于定量測定藥品、生物制品、血液制品、醫(yī)療器械及食品定藥品、生物制品、血液制品、醫(yī)療器械及食品中的內毒素含量，更重要的是在臨床上用來測定中的內毒素含量，更重要的是在臨床上用來測定病人各種體液中細菌內毒素的含量水平，以診斷病人各種體液中細菌內毒素的含量水平，以診斷及鑒別診斷內毒素血癥及感染的類型和程度，也及鑒別診斷內毒素血癥及感染的類型和程度，也作為觀察內毒素血癥療效的重要指標。作為觀察內毒素血癥療效的重

14、要指標。20l檢測原理檢測原理 主要原理與鱟試驗的反應原理相同：利用革主要原理與鱟試驗的反應原理相同：利用革蘭氏陰性菌脂多糖激活酶反應主劑蘭氏陰性菌脂多糖激活酶反應主劑A中的相應因中的相應因子后形成凝固蛋白，根據(jù)其引起的濁度變化對革子后形成凝固蛋白，根據(jù)其引起的濁度變化對革蘭氏陰性菌脂多糖濃度進行定量測定。蘭氏陰性菌脂多糖濃度進行定量測定。21三、內毒素檢測的臨床意義三、內毒素檢測的臨床意義正常參考值：正常參考值：正常人血漿內毒素含量正常人血漿內毒素含量80%），而且血清丙氨酸轉氨酶水平與內毒素血癥發(fā)），而且血清丙氨酸轉氨酶水平與內毒素血癥發(fā)生率及含量無明顯關系。生率及含量無明顯關系。24肝硬

15、化：肝硬化：肝臟可攝取血流中內毒素的肝臟可攝取血流中內毒素的8090%，由于，由于肝硬變后造成的肝枯否氏細胞清除能力下降及肝內肝硬變后造成的肝枯否氏細胞清除能力下降及肝內組織結構和血流的改變，肝內毒素攝取減少，造成組織結構和血流的改變，肝內毒素攝取減少，造成嚴重的內毒素血癥。嚴重的內毒素血癥。膽道疾病膽道疾病：膽石癥伴膽囊炎的內毒素血癥的發(fā)生率：膽石癥伴膽囊炎的內毒素血癥的發(fā)生率為為78；化膿性膽管炎為；化膿性膽管炎為20；梗阻性黃疸的程度；梗阻性黃疸的程度與內毒素濃度以及持續(xù)時間有一定關系，術后的內與內毒素濃度以及持續(xù)時間有一定關系，術后的內毒素血癥發(fā)病率為毒素血癥發(fā)病率為5075%，是術后

16、出現(xiàn)并發(fā)癥，是術后出現(xiàn)并發(fā)癥和患者死亡的一個重要原因。和患者死亡的一個重要原因。25急性胰腺炎：急性胰腺炎：急性胰腺炎并發(fā)內毒素血癥較常見，約占急性胰腺炎并發(fā)內毒素血癥較常見，約占66，值得注意的是致死病例生前均并發(fā)內毒素血癥且持續(xù)存，值得注意的是致死病例生前均并發(fā)內毒素血癥且持續(xù)存在直至死亡。因此早期測定內毒素水平有助于判斷疾病的嚴在直至死亡。因此早期測定內毒素水平有助于判斷疾病的嚴重程度，指導治療，防止惡化。重程度，指導治療，防止惡化。潰瘍性結腸炎：潰瘍性結腸炎：此病的內毒素血癥發(fā)病率高達此病的內毒素血癥發(fā)病率高達100，也，也有個別報道的陽性率僅為有個別報道的陽性率僅為25。但多數(shù)認為內

17、毒素血癥是該。但多數(shù)認為內毒素血癥是該病的重要并發(fā)癥。病的重要并發(fā)癥。26細菌性感染的輔助診斷、治療和預后判斷細菌性感染的輔助診斷、治療和預后判斷l(xiāng)全身性細菌感染：全身性細菌感染：全身性細菌感染主要見于敗血全身性細菌感染主要見于敗血癥。革蘭氏陰性細菌性敗血癥常并發(fā)內毒素血癥。癥。革蘭氏陰性細菌性敗血癥常并發(fā)內毒素血癥。這種敗血癥較常見的致病菌為沙門氏菌屬、腦膜這種敗血癥較常見的致病菌為沙門氏菌屬、腦膜炎雙球菌屬及擬桿菌屬。這些致病菌多通過泌尿炎雙球菌屬及擬桿菌屬。這些致病菌多通過泌尿道、腸道、膽道及呼吸道而引起感染，也可通過道、腸道、膽道及呼吸道而引起感染，也可通過外傷、外科手術、導管檢查或留

18、置，以及器械操外傷、外科手術、導管檢查或留置，以及器械操作等途徑而進入血液，并大量繁殖引起敗血癥，作等途徑而進入血液，并大量繁殖引起敗血癥，從而造成內毒素血癥。從而造成內毒素血癥。27l局部性細菌感染：局部性細菌感染：局部性細菌感染造成內毒素血局部性細菌感染造成內毒素血癥的有肺炎、膽囊炎、燒傷合并感染、穿孔性腹癥的有肺炎、膽囊炎、燒傷合并感染、穿孔性腹膜炎、化膿性膽管炎、肝膿腫、腎盂炎、卵巢囊膜炎、化膿性膽管炎、肝膿腫、腎盂炎、卵巢囊腫扭轉伴尿路感染、腸結核及肺結核伴綠膿桿菌腫扭轉伴尿路感染、腸結核及肺結核伴綠膿桿菌感染、非特異性出血性小腸炎及腎周圍炎等。感染、非特異性出血性小腸炎及腎周圍炎等。l對尿液進行內毒素測定可成功地檢出革蘭氏陰性對尿液進行內毒素測定可成功地檢出革蘭氏陰性細 菌 菌 尿 癥