RNA提取實驗操作步驟、注意事項及問題指南

1、RNA 提取實驗操作步驟、注意事項及問題指南準備試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇，無 RNase的水或0.5% SDS （溶液均需用 DEPC處理 過的水配制） 。操作步驟：1. 勻漿處理a. 植物組織 :以葉片 RNA 提取為例 .取新鮮葉片在液氮中充分研磨或將葉片剪碎后直接在 Trizol 中研磨 , 研磨要迅速 ,最好不要超過 1min. ，大約 100mg 葉片使用 1 ml Trizol.b. 動物組織 :以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70 C凍存組織，每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進 行勻漿處理 .樣品體積一般不要超過 Trizol 體積的 10%.c.

2、單層培養(yǎng)細胞 .直接在培養(yǎng)板中加入 Trizol裂解細胞，每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次.注意 :Trizol 加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定 ,不是由細胞數(shù)決定 .如果 Trizol 加量不足 ,可能導致提取 的 RNA 中有 DNA 污染 .d. 細胞懸液：離心取細胞，每5-10 X 106動物、植物和酵母細胞或每 107細菌細胞加1ml Trizol。加Trizol 前不要洗滌細胞，以免降解 mRNA 。一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀處理。e. 血液處理：直接取新鮮的血液 ,加入 3 倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置 10min， 10 000rpm 離心 1min

3、。棄上清，收集白細胞沉淀。每1ml血液收集的白細胞沉淀中加入1ml Trizol。2. 將勻漿樣品在15-30 C放置5mim，使得核酸蛋白復合物完全分離。3. 可選步驟:4 C 10 000rpm離心10min,取上清。 如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結節(jié)部分等，可離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有 RNA。處理脂肪組織樣品時，上層是大量油脂,應除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。如不能渦旋混勻,可手動顛倒混勻 2min 代替。5. 4 C 1

4、0 000rpm離心10-15min，樣品會分成三層：紅色的有機相，中間層和上層無色的 水相，RNA主要在水相中，把水相（約600ul，約為所用Trizol試劑的60%）轉移到新管中。（如要分離蛋白質和 DNA，可保留黃色的有機相）6. 在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇，混勻，-20 C放置20-30min。植物或動物組織 RNA 提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,導致電泳檢測時看不到RNA。可以按以下步驟操作減輕污染：在上清中加入1/2體積的異丙醇，1/2體積的RNA助沉劑,然后進行以下操作。7. 4 °C 10 000rpm 離心 10min，去上清。離心前 RNA 沉淀

5、經常是看不見的,離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。8. 加入1ml 75%乙醇（DEPC水處理過的水配制）洗滌沉淀。每使用 1ml Trizol至少加1ml 乙醇。9. 4 C 10 000rpm 離心 2min ,棄上清；短暫快速離心,用移液器小心吸棄上清,注意不要 吸棄沉淀。10. 室溫放置晾干（不要晾得過干, RNA 完全干燥后會很難溶解,大約晾干 2-3min 左右即 可）。加入適量DEPC水（根據(jù)實驗需要， 可加30-100UI水）或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次， 充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100 %的去離子甲 酰胺溶解，-70 C保存。注意

6、事項：1. 從少量樣品中提取 RNA（1-10mg 組織或 102-104 細胞 ） ：加800ul Trizol，樣品裂解后加氯仿，分層，沉淀 RNA前，力口 5-10ug RNase-free糖原，糖原 會與 RNA 一同沉淀出來， 糖原濃度不高于 4mg/ml 時不會影響反轉錄 cDNA 第一鏈的合成， 也不影響 PCR 反應。2. 勻漿后，加氯仿前，樣品可在-70 C放置一個月以上：RNA沉淀可以保存在 75%酒精中，2-8 C一個星期或-20 C一年以上。如果要長期保存， RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中，-70 C長期保存。預防RNase污染，應注意以下幾個方面：1. 經常更

7、換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。2. 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。3. RNA在Trizol試劑中不會被 RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150 C烘烤4h,塑料器皿可在 0.5M NaOH中浸泡10min, 然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。4. 配制溶液應使用無 RNase 的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC 至中濃度0.1%（v/v） ，放置過夜，高壓滅菌。注： DEPC 有致癌之嫌，需小心操作） 。不同組織或細胞 RNA 提取預期得率植物葉片 100-200u

8、g/g 葉片 動物組織 200-400ug/g 肝臟組織動植物培養(yǎng)細胞 5-10ug/106 細胞大腸桿菌 2-10ug/mlDH5 a過夜菌 血液 3-5ug/ml 人全血問題指南：低得率A. 樣品裂解或勻漿處理不徹底B. 最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解A260/A280<1.65A. 檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下A280會較高。B. 樣品勻漿時加的試劑量太少。C. 勻漿后樣品未在室溫放置5min。D. 水相中混有有機相。E. 最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解。RNA 降解A. 組織取出后沒有馬上處理或冷凍。B. 樣品或提取的 RNA

9、沉淀保存于-5-20 C,未在-60-70 C保存。C. 細胞在胰蛋白酶處理時被破壞。D. 溶液或離心管未經 RNase 去除處理。E. 電泳時使用的甲酰胺 pH 低于 3.5。DNA 污染A. 樣品勻漿時加的試劑體積太少。B. 樣品中含有組織溶劑（如乙醇， DMSO 等），強緩沖液或堿性溶液。 蛋白和多糖污染A. 樣品中蛋白、多糖含量高。B. 樣品量太大。C. 水相中混有有機相。D. 第 6 步中加入 RNA 助沉劑可以幫助去除這些污染。RNA 提取一般步驟總結RNA 提取原理：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA ，再經過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于 RNA

10、 酶無處不在，隨時可能將 RNA 降解，所以實驗中有 很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。RNA 提取的一般步驟所有 RNA 的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋 白復合體變性；對內源 RNA 酶的有效抑制；有效地將 RNA 從 DNA 和蛋白混合物中分離； 對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活 性。 RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA 與蛋白質進入有機相而 RNA 留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA 的丟失，目前該方法的

11、使用頻率已很低。實驗步驟：破碎組織t分離 RNAt沉淀 RNA t洗滌 RNA宀融解 RNA宀保存 RNA。1、 破碎組織和滅活 RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋 白酶K等破碎組織，加入 3 -ME可以抑制RNA酶活性。2、分離 RNA 一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA 一般分布于上層，與蛋白層分開。3、沉淀RNA 一般用乙醇、3M NaAc (pH-5.2 )或異丙醇。4、 洗滌 RNA 使用 70乙醇洗滌，有時，為避免RNA 被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后 可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。5、融解 R

12、NA 一般使用 TE。6、 保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含 RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的 RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的 RNA ，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量 RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存 RNA 樣品的穩(wěn)定性，可以將 RNA 溶解在去離子的甲酰 胺中，存于-70 C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用 RNA

13、 時，可以使用下列方法沉淀 RNA： 加入NaAc至0.3M , 12,000 X g離心5分鐘。氯化鋰法提取總 RNA ：本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制 RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀 RNA，其特別適 合于從大量樣品中提取少量組織 RNA,具有快速簡潔的長處， 但也存在少量 DNA的污染及 RNA 得率不高 ,小 RNA 丟失的缺陷。試驗試劑：1、 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰 126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,過濾滅菌】2、懸浮液【 10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】試驗步驟：1、 對于大量組織或細胞，則每克組

14、織或細胞加入510ml 氯化鋰尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞(107個細胞/ml),則每克組織或細胞加入 0.5ml氯化鋰尿 素溶液手工勻槳，并轉移至 Eppendof 管中。2、 勻槳液在0 4C放置4小時后，12000g離心30分鐘。3、 取沉淀，加入原勻槳液 1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復步驟2。4、 沉淀用原勻槳液 1/2 體積的氯化鋰尿素溶液復溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室 溫放置 1530 分鐘并不時搖動混勻， 4000g 離心 5 分鐘。5、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20C放置1 小時， 5000g 離心。6、

15、70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA，分裝，于70C保存。蛋白酶熱酚法本方法適合于病毒 RNA 的提取 試驗試劑：1、蛋白酶K (終濃度50ug/ml)2、2X緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2M naCL 試驗步驟：1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶 K,37 C 40-50分鐘。2、 加入等體積65C預熱的酚溶液，輕徭，在65C保溫5分鐘后再輕徭。3、離心，取上清，氯仿抽提一次。4、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20C放置1 小時，5000g 離心（10000g,10min

16、）。5、70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。6、 RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA，分裝，于70C保存。RNA 提取實驗經驗心得總結一：實驗的準備 實驗之前必須先準備好相關的試劑和實驗用品試劑：1 .TRIZOL, 步法提取 RNA 用的，最好是 INVITROGENE 的，10 0 ml850RMB, 不過也有國產的， 便宜些 這個試劑是非常關鍵的， 也是不能省的， 經常有很多朋友不想買 這個， 嫌貴， 個人感覺是非買不可， 不然用其他辦法自己配的話也不便宜， 而且配的過程中 很毒2異丙醇，無水乙醇，三氯甲烷（氯仿），DEPC3 .逆轉錄酶等一般如果做的次數(shù)不是很多的話可以買試劑盒的，里面什么都有

17、，PROMEGA的也不是很貴， 記得是30次的600多. 但是如果實驗室做得比較多的話， 還是 自己分開買的比較好. MMLV逆轉錄酶個人覺得PROMEGA的最好，而且不貴，其他公司我用得也不多， 反正一直用PROMEGA, 還有DNTP, oligod（T） n,RNA 酶抑制 劑，除了逆轉錄酶買 PROMEGA的，其他的幾樣我都是買的TAKARA的，因為promega的其他幾樣都很貴，這樣配起來用一點也不比原裝的差.當然實驗室比較富裕的也 可以買好的， 不過話說回來， 咱們花的經費大多數(shù)還是民脂民膏， 這些不太關鍵的地方省著 點比較好（我是不是太羅嗦了！ ）4 .用具.各種大小的槍頭和EP

18、管。由于RNA提取過程中對于 RNA酶是非常敏感的，所以槍頭和管子都要做滅酶處理。滅酶的正常程序是用加入 DEPC 的水泡槍頭和管子，過夜。 DEPC 的濃度是 0.1%。 DEPC 是強致癌物，做的時候要戴手套口罩，作好防護措施。泡好后再高 壓，烘干。滅酶除了用 DEPC 處理外，還可以用氯仿泡槍頭和管子，不用泡過夜，1-2小時就行，也沒有 DEPC 那么恐怖，泡后也是高壓烘干。5. 水。實驗用的水也是很關鍵的，必須用 DEPC 處理滅過酶的水才可以。具體做法是將去 離子水中加入 0.1%DEPC ，搖過夜，之后再高壓。高壓這步是不能省的，因為必須用高壓把 殘留的 DEPC 分解掉，不然會影

19、響后續(xù)的反應。二實驗步驟TRIZOL 提取 RNA 的原理就是利用變性劑將細胞裂解，釋放出蛋白質，DNA ，RNA ，之后根據(jù)它們在不同 PH 值和不同極性溶劑中溶解度不一樣。而把 RNA 提取出來。詳細的原理 可以自己查一查，在這里不做贅述。1. 樣品處理對于組織樣品， 書上說的辦法是勻漿后加 TRIZOL ，但是我的經驗是用勻漿器勻漿的話很多 組織都是沾在勻漿器的壁上了， 所以我一般都是用小剪刀剪， 剪的時候要耐心， 剪得很碎才 行。一般樣品其始量大概黃豆那么大一坨就行了， 加 1mlTRIZOL ，然后在 EP 管中剪碎。 樣 品盡量用新鮮的， 不是新鮮的泡在 PBS 中一段時間也行。

20、樣品泡在 TRIZOL 里面后 RNA 就 基本不會降解，這一步可以放在冰箱里面凍起來，可以保存一段時間2. RNA 提取。往第一步中的剪碎的樣品和 TRIZOL 中加入 0.2ml 的氯仿，之后劇烈搖晃。震蕩，此時整個 液體的顏色應該變成一種粉紅色的。之后靜置 10 分鐘，靜置后可以看到液體分層了。12000 轉 4 度離心 10 分鐘，可以看見液體分層很明顯，最上面的是無色的水相， RNA 就溶解在里面，中間一層是白色的固體，這層是蛋白質和 DNA 形成的復合體，下面是紅色 的酚相。 把上層水相吸到另外一個管子里面， 注意不要把下面的兩層吸出來了， 寧愿少一下 沒關系。往水相液體中加入 5

21、00ul 的無水乙醇或者是異丙醇， 上下顛倒混勻， 此時如果 RNA 量多 的話可以看見一些油一樣的東西， 反正就是感覺怪怪的那種， 不過一般都不會出現(xiàn)明顯的沉 淀的。之后 12000 轉離心 10 分鐘，離心之后就可以看見管底有點半透明的東西了，那就是 我們要 RNA 。倒掉無水乙醇或者異丙醇， 加入 500ul 用 DEPC 處理水配制的 70%乙醇， 以洗滌 RNA， 加入后把管子敲一敲，盡量使 RNA 沉淀飄起來。之后在 7500 轉離心 8 分鐘，到掉乙醇， 倒扣在干凈的吸水紙上面，空氣室溫干燥，時間可以稍長點， 40 分鐘到 1 小時，以看不見 明顯的液滴為準。干后用20ul或者30UIDEPC水溶解RNA , 50度保溫1小時。之后得