生物選修一第四章導(dǎo)學(xué)案(共9頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上編號(hào)：課題 ：蛋白質(zhì)的提取和分離 課時(shí)： 主編人：王富嬌審核人：趙長(zhǎng)敏審批人：劉偉日期班組：姓名：組評(píng)：師評(píng)：學(xué)習(xí)目標(biāo)：1.嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理學(xué)習(xí)重、難點(diǎn)：1.凝膠色譜法的原理和方法2.樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填第一學(xué)習(xí)時(shí)間 自 主 預(yù) 習(xí) 不看不講& 基礎(chǔ)知識(shí)梳理（系統(tǒng)形象化）知識(shí)回顧：血液由 和 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有 的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是 ，血紅蛋白有 個(gè)肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè) ，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。 思考1

2、：你認(rèn)為鳥(niǎo)類(lèi)血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？ 思考2：與其它真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？基礎(chǔ)知識(shí)一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。2、 實(shí)驗(yàn)步驟可分為四大步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。1樣品處理 （1）紅細(xì)胞的洗滌目的：去除 雜質(zhì)蛋白 方法：低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的 黃色血漿，將下層暗紅色的的紅細(xì)胞液體倒入燒杯再加入用 五倍的 體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0

3、9的氯化鈉溶液洗滌。低速離心（低速短時(shí)間）重復(fù)4、5步驟 三 次，直至上清液中已沒(méi)有 黃色 ，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過(guò)少。（2）血紅蛋白的釋放在蒸餾水和40%甲苯作用下，攪拌10min,紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，破碎的方法不同，常用有： 2. 粗分離分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第1層為無(wú)色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)沉

4、淀物(暗紅色)。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。目的：可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。3 純化（一般采用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行分離和純化）純化主要是根據(jù)蛋白質(zhì)之間以及 與其他物質(zhì)之間在分子大小、 、 、 等方面純?cè)诘牟町愡M(jìn)行的。常用的方法有： （其原理見(jiàn)名師P38）4. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定判斷 的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血

5、紅蛋白純度SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。思考：是否所有種類(lèi)的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？ 第二學(xué)習(xí)時(shí)間 新 知 學(xué) 習(xí) 不議不講& 重難點(diǎn)合作探究（技能系統(tǒng)化）一凝膠色譜法（原理）凝膠色譜法也稱(chēng)做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ；而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。具體過(guò)程：凝膠顆粒相對(duì)

6、分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A 的蛋白質(zhì)由于 作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留； 的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過(guò)。B1） 混合物上柱；2）洗脫開(kāi)始， 的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)； 的蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外；3） 的蛋白質(zhì)被滯留； 的蛋白質(zhì)被向下移動(dòng)。4） 不同的蛋白質(zhì)分子完全分開(kāi)；5） 的蛋白質(zhì)行程較短，已從 中洗脫出來(lái)， 的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。2緩沖溶液緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，例如：血漿的pH是 ，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)

7、程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。思考：說(shuō)出人體血液中緩沖對(duì)？ 思考：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？3凝膠色譜操作第一步要制作 ，第二步要 ，因?yàn)?，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有 存在。因?yàn)闅馀輹?huì) ，降低分離效果。第三步是 。用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì) （ ）A路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢 B路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D路程較短，移動(dòng)速度較快二、電泳（1）概念：電泳是指 。（2）原理：許多重要的生物大分子，如 等都具有 。 在 下，這些基團(tuán)會(huì)帶上 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與

8、其 移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子 以及分子本身 、 的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是 和 ，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。（3）泳動(dòng)特點(diǎn)：帶電顆粒直徑越小，越接近于球形，所帶近電荷 ， 在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度就 ，反之，則慢。三、注意事項(xiàng)1. 電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。2加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液

9、凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。3與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義？哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒(méi)有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。4. 紅細(xì)胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。5如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支

10、與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。6為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。7沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的？不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。8G-75的含義？“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨

11、脹時(shí)吸水7.5g。9裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密10如何檢測(cè)血紅蛋白的分離是否成功？如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。11. 如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量?！菊n堂總結(jié)】血紅蛋白的取和分離凝膠色譜法原理分離過(guò)程凝膠電泳法緩沖溶液組

12、成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和離蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過(guò)程凝膠電泳法凝膠色譜法原理分離過(guò)程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定第三學(xué)習(xí)時(shí)間 課 程 訓(xùn) 練 不練不講! 自我檢測(cè)（能力具體化，練習(xí)層次化）一、非選擇題1、細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題： （1）血紅蛋白提取和分離的程度可

13、分為四步：_、_、_和_。（2）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來(lái)，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。 加入檸檬酸鈉的目的是_。 以上所述的過(guò)程即是樣品處理，它包括_、_、收集血紅蛋白溶液。（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過(guò)透析，這就是樣品的粗分離。 透析的目的是_。 透析的原理是_。（4）然后通過(guò)凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 樣品純化的目的是_。 血紅蛋白有什么特點(diǎn)？_。這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？_。2、下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時(shí)樣品的加入(圖I)和洗脫(圖)示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題。(1)在加

14、樣示意圖中，正確的加樣順序是 。(2)用吸管加樣時(shí)，應(yīng)注意正確操作，分別是 。貼著管壁加樣、 。(3)等樣品 。時(shí)，才加入緩沖液 。待 接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每 mL收集一管，連續(xù)收集。3、凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且，已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問(wèn)題：（1）a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來(lái)的是 ，原因是 。（2）自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由 替代。（3）裝填凝膠色譜柱時(shí)，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是 。（4）洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體 (填“相同”或“不同”)，洗脫時(shí)，對(duì)洗脫液的流速要求是 。49早在上世紀(jì)六十年代，在美國(guó)的黃石國(guó)家森林公園發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱細(xì)菌，從這種細(xì)菌中分離提取了一種酶，稱(chēng)為T(mén)aqDNA聚合酶。實(shí)驗(yàn)得知PCR反應(yīng)變性時(shí)溫度為950C，經(jīng)50個(gè)循環(huán)后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性； TaqDNA聚合酶表現(xiàn)為Mg2+依賴(lài)，濃度在20mmol/L的MgCl2能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性 ； （1）若要培養(yǎng)嗜熱細(xì)菌，培養(yǎng)基中應(yīng)有水、碳源、 、 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)