有機溶劑沉淀

1、制作人：蔣益德 學(xué)號：1109080014 日期：2013.12.251.說出有機溶劑沉淀法的原理2.說出有機溶劑沉淀時需具備哪些條件向水溶液里加入一定量親水性有機溶劑，降低溶劑的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法謂之“有機溶劑沉淀法”。其機理有二。（一）親水性有機溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。根據(jù)庫倫公式：帶電質(zhì)點間的靜電作用力在質(zhì)點電量不變，質(zhì)點間距離不變的情況下與介質(zhì)的介電常數(shù)成反比。（2）水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了他的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。以上兩個因素相比較，脫水作用可能

2、較靜電作用占更主要的地位。乙醇、丙酮的介電常數(shù)都較低，是最常用的沉淀用溶劑。2.5mol/L甘氨酸的介電常數(shù)很大，可以做蛋白質(zhì)等生物高分子溶液的穩(wěn)定劑。有機溶劑沉淀生物高分子的特點是：分辨率高于鹽析；因溶劑沸點較低，除去及回收方便。但有機溶劑沉淀法比鹽析法易使蛋白質(zhì)變性失活。沉淀用有機溶劑的選擇主要考慮以下幾個方面的因素：（1）介電常數(shù)小，沉淀作用強。（2）對生物分子的變性作用小。（3）毒性小，揮發(fā)性適中。（4）沉淀用溶劑一般需能與水無限混溶，一些與水部分混溶或微溶的溶劑如氯仿、乙醚等也有使用。乙醇，由于沉淀作用強，沸點適中，無毒等優(yōu)點，廣泛用于沉淀蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物高分子及氨基酸等。丙

3、酮，沉淀作用大于乙醇。用丙酮代替乙醇作沉淀劑一般可以減少用量1/4到1/3。但沸點較低，揮發(fā)損失大，對肝臟有一定毒性，著火點低等缺點應(yīng)用不如乙醇廣泛。甲醇，沉淀作用與乙醇相當(dāng)，但對蛋白質(zhì)的變性作用比乙醇，丙酮都小，由于口服強毒，限制了他的使用。其他溶劑，如二甲基甲酰胺、二甲基 亞楓，也可以作沉淀劑用。有機溶劑沉淀時，溫度是重要的因素，有機溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著的減少，因此低溫下（最好低于0）沉淀的完全。有機溶劑會引起蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)變形，如果這種變形超過一定程度，就會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，變性的危險隨溫度升高而增大，為了防止蛋白質(zhì)變性，應(yīng)在低溫下沉淀。實際操作中，還要考慮

4、有機溶劑與水混合時熱量的驅(qū)散。因此，整個操作過程需要高度冷卻。一般先將蛋白質(zhì)溶液冷卻到0攝氏度左右，并把有機溶劑預(yù)冷到更低溫度，在充分攪拌下加入冷的有機溶劑，以避免局部過濃應(yīng)其蛋白質(zhì)變性。注意：但對穩(wěn)定性較好的生化物質(zhì)如淀粉酶，溫度不需過低，沉淀溫度可控制在10-15C。此外，應(yīng)控制溶劑的加入速度，不宜過快。等電點時蛋白質(zhì)溶解度最低，因此有機溶劑沉淀時，溶液ph應(yīng)盡量在蛋白質(zhì)等電點附近，但是ph的控制還必須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。例如很多酶的等電點在ph4-5之間，比其他穩(wěn)定的ph范圍低，因此ph應(yīng)首先滿足蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件，不能過低。另外，應(yīng)避免讓目的物與主要雜質(zhì)帶相反電荷，導(dǎo)致嚴重共沉作用。較

5、低離子強度的存在往往有利于沉淀作用，甚至還有保護蛋白質(zhì)，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩(wěn)定介質(zhì)ph的作用。用溶劑沉淀蛋白質(zhì)時離子強度以0.01-0.05mol/L為好，通常不應(yīng)超過5%的含量。常用的所謂助沉劑多為低濃度的單價鹽，有醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。這可能是增加了蛋白質(zhì)分子的表面電荷，從而增強了分子間引力之故。 少量中性鹽【離子強度較高時（0.2mol/L以上）】的存在，由于鹽溶作用，會增大蛋白質(zhì)在有機溶劑-水溶液的溶解度，并隨離子強度增大而增大，所以用有機溶劑沉淀時應(yīng)減少無機量。用硫酸銨鹽析所得的沉淀物，如進一步用有機溶劑沉淀純化，則事先應(yīng)經(jīng)脫鹽，否則會增加有機溶劑用量。與鹽析相似，樣品較稀時增加了溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)收率，還易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉作用小，分離效果好。反之濃的樣品會增加共沉作用，降低分辨率，變性的危險性也小于稀溶液。一般認為蛋白質(zhì)的初濃度以0.5%2%為好，粘多糖則以1%2%較合適。與鹽析法相比，有機溶劑沉淀法具有如下優(yōu)點：1乙醇等有機溶劑易揮發(fā)