乳腺癌HERFISH檢測、判讀及報告

1、乳腺癌HER2 FISH僉測-檢測意義、建議及標(biāo)本準(zhǔn)備HER2與孚L腺癌乳腺癌是女性惡性腫瘤中發(fā)病率最高的一種,正以每年3%4%的速度急劇上升,已成為女性的第一殺手.臨床上大約20-35%的浸潤性乳腺癌存在 HER2基因的擴(kuò)增及蛋白的 高表達(dá).HER2基因又名HER2/neu , c-erbB-2位于17q12,是表皮生長因子受體 HER 家族成員之一,HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用.HER2編碼相對分子量185KD的跨膜受體樣蛋白,具有酪氨酸激酶活性.HER2是重要的乳腺癌預(yù)后判斷因子,HER2陽性過表達(dá)或擴(kuò)增的乳腺癌,其臨床特點(diǎn)和生物學(xué)行為有特殊表現(xiàn),治療模式也 與其他類型的

2、乳腺癌有很大的區(qū)別.HER2檢測方法有免疫組化IHC和熒光原位雜交FISH等.?2021年NCCN乳 腺癌臨床實踐指南?和?乳腺癌 HER2檢測指南2021版?均強(qiáng)調(diào)：FISH是檢測HER2基 因狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn).一 .檢測意義1 .判斷預(yù)后：HER2陽性的乳腺癌浸潤性強(qiáng),無病生存期短,預(yù)后差.2 .指導(dǎo)治療：HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對內(nèi)分泌治療藥物如他莫昔芬產(chǎn)生耐藥.HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對 CMF方案不敏感,宜采用大劑量慈環(huán)類藥物和紫杉醇類藥 物方案；HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者明顯受益于Herceptin 赫賽汀,2001年FDA批準(zhǔn)上市等靶向藥物治療.二.檢測建議IHC和FISH

3、檢測HER2的狀態(tài)一致性很高, 但也存在著差異, 數(shù)據(jù)統(tǒng)計如下表1和表2示,對于IHC 2+樣本必須要用FISH進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果；0、1+或3+ ,根據(jù)條件,可再做FISH驗證.Figmre 1 Pwreinand Gene Annpldkertion02+AIHC 瞿eehq L,v電I表 1 : (2004) HER2 Amplification Ratios byFluorescence In Situ Hybridization andCorrelation with Immunohistochemistry in aCohort of 6556 Breast Cancer Tissue

4、s. ClinicalBreast CancerIHC -FISH陽性率%陰性陽性0892565.91 +51421129.12+32741555.93+7466089.9表2: 2007年衛(wèi)生部科教司牽頭組織全國 73家三級以上醫(yī)院歷時2年完成“熒光原位雜交技術(shù)FISH用于乳腺癌患者Her-2檢測的臨床研究課題, 檢測標(biāo)本達(dá)3368例因此, ?2021年NCCN乳腺癌臨床實踐指南?和?乳腺癌HER2檢測指南2021版?均建議先進(jìn)行 HER2蛋白的IHC檢測,IHC 2+樣本進(jìn)行ISH FISH、DISH或CISH 檢測. HER2HIMP 虹Muas mllex CMC wi Mi ISH

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6、non wilabtoi .p-p HERM EPI?-b AdvMgi H£R2tCf>y1 ISH 的.flftO JXD.AjvvrwHER號叼HE1R2 Ming Aitajmb«r 川LD MgfMj&fcftMI3H *|i.HERJccfiyVMwbor signa kifcail 伊ISH HHER2CEP17.A#«i9« HERZcwr nu*nb«rEqwv«alMO M HjO qWWI“ rwult* huntber ti9iuMr»ilM«t f*1tKX twt win

7、MC if um« WHimK Iwt with iltimiiv* 焙 H dwwiownw ITpratM, nr or ctor a n«w wlEh I8H xlHC 倡 rww ptdwi *«2021年NCCN乳腺癌臨床實踐指南?三.樣本準(zhǔn)備：1 .標(biāo)本類型：1手術(shù)切除標(biāo)本；2粗針穿刺活檢標(biāo)本；3活檢標(biāo)本.2 .標(biāo)本固定：所有乳腺癌標(biāo)本離體后都應(yīng)盡快固定1h內(nèi)固定.固定時應(yīng)將標(biāo)本每隔 510 mm 切開,并可在組織間嵌入紗布或濾紙等物.固定液量與所浸泡組織的比例應(yīng)足夠.固定時間以6 72h為宜.3 .固定液類型：4%中性磷酸緩沖甲醛固定液.4 .組織切

8、片：1切片厚度3-5um ; 2應(yīng)有HE染色切片作為對照.四.臨床上哪些患者需要進(jìn)行HER2檢測1 .所有乳腺原發(fā)性浸潤癌都應(yīng)進(jìn)行HER2檢測；2 .只要能獲取腫瘤組織,對復(fù)發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶也應(yīng)該進(jìn)行HER2檢測；3 .如HER2檢測結(jié)果為陰性,但疾病復(fù)發(fā)且生物學(xué)行為提示可能為HER2陽性腫瘤時,應(yīng)重復(fù)HER2檢測；4 .如HER2檢測結(jié)果與組織病理學(xué)特征不相符時,如組織學(xué)分級為I級的浸潤性乳腺癌 HER2陽性,應(yīng)重復(fù)HER2檢測.組織學(xué)1級的類型腺癌：?浸潤性導(dǎo)管或小葉癌,ER和PR陽性?小管癌至少90%為純小管癌?粘液癌至少90%為純粘液癌?篩狀癌至少90%為純篩狀癌?腺樣囊性癌至少90%為純

9、腺樣囊性癌且常為三陰性孚L腺癌HER2 FISH檢測-判讀一 .信號觀察流程1 .首先在HE/IHC切片上確認(rèn)腫瘤區(qū)域；2 .在10 X物鏡下,于FISH標(biāo)本上找到與 HE染色切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)；3 .在40 X物鏡下掃描整張切片,觀察是否存在異質(zhì)性,要求至少找到2個浸潤癌區(qū)域,計數(shù)至少20個浸潤癌細(xì)胞.滿意的標(biāo)本應(yīng)是 75%以上癌細(xì)胞核中有雜交信號；4 .在100 X物鏡下觀察癌細(xì)胞核的 FISH結(jié)果進(jìn)行信號計數(shù),注意上下調(diào)整焦距,以免遺漏 信號.二.實驗失敗、不能判讀的情況1 .因操作等原因,細(xì)胞核被損壞,邊界不完整；2 .組織過度消化,細(xì)胞核邊界不完整,DAPI染色淺；3 .組織消

10、化缺乏,25%以上的細(xì)胞核無信號；4 .自發(fā)熒光很強(qiáng)或細(xì)胞核分辨差,10%細(xì)胞核外有信號.三.計數(shù)要求1 .計數(shù)區(qū)域可結(jié)合蘇木精伊紅染色進(jìn)行腫瘤細(xì)胞標(biāo)識；2 .選擇具較好核分界的區(qū)域,要求細(xì)胞核大小根本一致、邊界完整,DAPI染色均勻、核無重疊,綠色著絲粒信號清楚；3 .隨機(jī)計數(shù)確定的腫瘤區(qū)域中2030個細(xì)胞核中的雙色信號,不要主觀選擇信號多的核計數(shù)；4 .不要計數(shù)僅顯示一種顏色信號的細(xì)胞核；5 .防止計數(shù)分裂像的細(xì)胞核或被細(xì)胞核分裂及邊界不完整核；6 .如果2個同樣大小的橘紅信號之間距離缺乏一個常規(guī)橘紅信號大小,只計為一個信號；7 .假設(shè)紅、綠兩信號的比值 >20或眾多信號連接成簇時可

11、不計數(shù),視為基因擴(kuò)增；8 .假設(shè)為臨界值,那么需要再計數(shù)20個細(xì)胞核中的信號或由另外一個觀察者重新計數(shù),如仍為臨界值,那么應(yīng)在 FISH檢測報告中注明,或換其它方法或其它蠟塊重新檢測；9 .假設(shè)HER2基因擴(kuò)增在不同癌細(xì)胞中存在異質(zhì)性時,應(yīng)在另一癌區(qū)域再計算 2030個癌細(xì)胞核中的紅、綠信號值,報告其最大值,并加以注釋；10 .判讀時可以將乳腺組織中的正常細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、正常乳腺上皮細(xì)胞的HER2信號和CSP17信號作為內(nèi)對照.如修局部里包伯號不在國區(qū)域內(nèi).|卜淵胞松內(nèi)為兩個投色一兩個綠色訃數(shù)為:兩個柢也佑號和何不綠色心號. 個糧 色信號擴(kuò)敬.不口改如吐枝后仆,W：&

12、quot;隹/肝枇細(xì)嘀嶂K 域進(jìn)行價并.有此假號在川收乂除網(wǎng).訃收內(nèi)：陰個超色信“利曲小綠色小出 色的號他裂開,計數(shù)為,個料色埼弓和曲外綠色依年.個瞅計也為,明十種色門號和 個微色噴號.H故;.個糖色匚卜個蛙色啕材能為1 I'l,個竹色小,；和兩個表色用小色格號眩瞿什.根也格的也被裂開.-揖包扉針,CEP17 - ffiftW, LSI HCn-rieu一些常見信號類型及計數(shù)方法摘自 乳腺癌HER-2基因檢測t劑盒FISH法說明書一Abbott Moleular Inc.四.結(jié)果判讀在清楚的腫瘤區(qū)域,按以上計數(shù)要求在至少 20個核內(nèi)計數(shù) GSP HER2 紅色和CSP17綠色信號,分別

13、記錄 GSP HER2和CSP17的信號總數(shù),再計算平均每個細(xì)胞HER2拷貝數(shù)、平均每個細(xì)胞 CSP17拷貝數(shù)以及 GSP HER2和CSP17比值.A.假設(shè) HER2/CSP17<2.0,且平均 HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0 , HER2陰性；B.假設(shè)HER2/CSP17<2.0,且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0 ,但> 4.0寸,HER2結(jié)果不確定；C.假設(shè) HER2/CSP17 > 2.0 ,明ER2/CSP17<2.0而 HER2 拷貝數(shù)/細(xì)胞> 6.0 HER2 陽性.?乳腺癌HER2檢測指南2021版?乳腺癌HER2檢測指南2021

14、版注：a：對于HER2/CSP17比值2.0 ,但平HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0的病例是否應(yīng)該視為 FISH陽性目前尚存爭議,建議對這局部病例在報告中加以備注,提示目前的爭議,建議臨床醫(yī)師參考免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果并與患者進(jìn)行必要的溝通；b:見于均質(zhì)、連續(xù)的浸潤細(xì)胞,且占浸潤癌的10%以上五.HER2 FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)的變化?乳腺癌HER2檢測指南2021版?判讀標(biāo)準(zhǔn)：A.假設(shè) HER2/CSP17<1.8 , HER2 陰性；B.假設(shè) HER2/CSP17 > 1.8 , 12.2 , HER2 結(jié)果不確定；C HER2/CSP17 2.2 HER2 .新舊判讀標(biāo)準(zhǔn)的比擬：2

15、021版新標(biāo)準(zhǔn)的截斷值為 2.0, 2021版老標(biāo)準(zhǔn)的截斷值為 1.8和2.2;2021版新標(biāo)準(zhǔn)不只是 HER2/CSP17的比值,需結(jié)合HER2基因的拷貝數(shù)進(jìn)行判讀；2021版那么僅根據(jù)HER2/CSP17的比值進(jìn)行判讀,不考慮 HER2基因拷貝數(shù).新舊判讀標(biāo)準(zhǔn)銜接中可能出現(xiàn)的問題：2021版新標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn) HER2檢測結(jié)果不確定的情況會比2021版標(biāo)準(zhǔn)更少；2021版新標(biāo)準(zhǔn)判讀陰陽性結(jié)合了HER2基因的拷貝數(shù),有些 2021版標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果為陰性的標(biāo)本,如果 HER2基因拷貝數(shù)?62021版新標(biāo)準(zhǔn)那么判為陽性.?乳腺癌HER2檢測指南2021版?與 ?乳腺癌HER2檢測指南2021版?乳腺癌HE

16、R2 FISH檢測-報告及結(jié)果解釋一 .報告要求?乳腺癌HER2檢測指南2021版?要求檢測報告包括如下內(nèi)容：患者信息包括姓名、性別、年齡、門診/住院號、送檢醫(yī)師姓名、送檢日期、標(biāo)本信息包括病理號和蠟塊號 卜標(biāo)本部位和類型、探針信息、檢測方法、是否使用圖像分析、對照設(shè)置情況、樣本量是否適 合評估、判讀結(jié)果包括評估的細(xì)胞數(shù)量、平均 HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞、平均CSP17拷貝數(shù)/ 細(xì)胞、平均HER2拷貝數(shù)/平均CSP17拷貝數(shù)的比值卜檢測結(jié)論如陽性、不確定、陰性、 無法判讀.這里強(qiáng)調(diào)兩個概念：17號染色體計數(shù)和 HER2異質(zhì)性.1. 17號染色體數(shù)目：FISH雙探針檢測系統(tǒng)中參加 CSP17探針的目

17、的是為了在檢測 HER2 基因的同時檢測17號染色體數(shù)目,從而區(qū)分 17號染色體的非整倍體與 HER2基因擴(kuò)增. 近年來的研究顯示17號染色體多倍體與 CSP17多信號點(diǎn)著絲粒區(qū)多點(diǎn)是不同的概念. 17號染色體多倍體較罕見,而局部乳腺癌中17號染色體上存在 HER2基因和著絲粒區(qū)的共同擴(kuò)增.越來越多的學(xué)者認(rèn)為, 與GSP HER2/CSP17比值相比,HER2拷貝數(shù)對于 HER2 基因擴(kuò)增的判斷更為重要 .因此在HER2 FISH檢測結(jié)果中除報告 GSP HER2/CSP17 比值 外,還應(yīng)分別報告 HER2拷貝數(shù)和CSP17的數(shù)值.2. HER2基因的異質(zhì)性：浸潤性乳腺癌中HER2表達(dá)或擴(kuò)增

18、可存在異質(zhì)性.雖然HER2基因異質(zhì)性的臨床意義目前仍不明確,但它可導(dǎo)致IHC與ISH檢測、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、穿刺標(biāo)本與手術(shù)切除標(biāo)本的檢測結(jié)果不一致.在ISH計數(shù)之前,應(yīng)觀察整張切片或使用IHC確定可能存但只要擴(kuò)增細(xì)胞連續(xù)、均質(zhì),且占在HER2擴(kuò)增的區(qū)域.需要強(qiáng)調(diào)的是,即使存在異質(zhì)性, 浸潤癌10 %以上,就應(yīng)明確報告為ISH陽性.在報告中可補(bǔ)充報告不同細(xì)胞群 10 %的計 數(shù)彳1包括計數(shù)的細(xì)胞總數(shù)、 HER2拷貝數(shù)、CSP17數(shù)值、GSP HER2/CSP17比值,并報告 擴(kuò)增細(xì)胞群占所有浸潤癌細(xì)胞的比例.常見結(jié)果及解釋FISH陰性HER2無擴(kuò)增,17號二倍體.GSPHER2/CSP17 紅色

19、/綠色2.0.FISH臨界,17號多倍體HER2基因伴隨多拷貝.GSPHER2/CSP17 紅色 /綠色2.0,但平均每個細(xì)胞 HER2拷 貝數(shù)為4.9個,介于4.0-6.0之 間.FISH陽性,17號多倍體.GSP HER2/CSP17 紅色 /綠色2.0,但平均每個細(xì)胞 HER2拷 貝數(shù)為6.8個,大于6.0.FISH陽性,17號染色體二倍體.GSP HER2/CSP17 紅色FISH陽性,17號染色體多倍體.GSP HER2/CSP17 紅色FISH陽性,17號染色體單倍體.GSP HER2/CSP17 紅色/ 綠色 2.0o/綠色 2.0./綠色2.0,平均每個細(xì)胞HER2拷貝數(shù)為2.0個,平均每個細(xì)胞CSP1