植物組織中可溶性糖含量的測(cè)定（蒽酮比色法）(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)方案一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)，掌握測(cè)定蘿卜品質(zhì)的方法（一） 蘿卜外部形態(tài)的測(cè)定1、 實(shí)驗(yàn)材料取鮮樣3個(gè)小區(qū) 直尺、蒸餾水、筆、記錄本、吸水紙2、 實(shí)驗(yàn)方法用自來水將各組蘿卜洗凈后，再用蒸餾水洗滌，擦干表面水分每個(gè)小區(qū)取3個(gè)重復(fù)，用電子天平稱量每株的鮮重，用直尺測(cè)量植株的莖長、莖粗、葉長，取平均值作為指標(biāo)值實(shí)驗(yàn)(二) 植物體內(nèi)可溶性糖含量的測(cè)定（蒽酮法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度計(jì)的使用二、實(shí)驗(yàn)原理 糖類物質(zhì)是構(gòu)成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì)。不同載培條件，不同成熟度都可以影響水果、蔬菜中糖類的含量。因此

2、對(duì)水果、蔬菜中可溶性糖的測(cè)定，可以了解和鑒定水果、蔬菜品質(zhì)的高低。蒽酮比色定糖法是一個(gè)快速而方便的定糖方法，在強(qiáng)酸性條件下，蒽酮可以與游離的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（還原性和非還原性）作用生成藍(lán)綠色的糖醛衍生物，其顏色的深淺與糖的含量在一定范圍內(nèi)成正比。蒽酮也可以和其他一些糖類發(fā)生反應(yīng)，但顯現(xiàn)的顏色不同。當(dāng)存在含有較多色氨酸的蛋白質(zhì)時(shí)，反應(yīng)不穩(wěn)定，呈現(xiàn)紅色。上述特定的糖類物質(zhì)，反應(yīng)較穩(wěn)定。該法特點(diǎn)：靈敏度高，測(cè)定量少，快速方便。三、材料、儀器及試劑 1.材料：植物種子、白菜葉、柑桔2.儀器：分光光度計(jì)；恒溫水箱； 20ml具塞刻度試管（3支） 漏斗；100ml容量瓶；刻度試

3、管；試管架；剪刀；研缽3.試劑 （1）200g/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖：AR級(jí)葡萄糖100mg，蒸餾水溶解，定容至500ml。（2）蒽酮試劑：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光處貯藏；（3）濃硫酸四、實(shí)驗(yàn)方法 1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支20ml具寒試管，編號(hào)，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮試劑，再緩慢地加入5ml濃H2SO4，搖勻后，打開試管塞，置沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻至室溫，在620nm波長下比色，測(cè)各管溶液的光密度值（OD），以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 管  號(hào)123456

4、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖原液(ml)(200g/ml)00.20.40.60.81.0蒸 餾 水2.01.81.61.41.21.0葡萄糖含量（g）040801201602002.樣品中可溶性糖的提取稱取1克白菜葉，剪碎，置于研缽中，加入少量蒸餾水，研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入20ml刻度試管中，用10ml蒸餾水分次洗滌研缽，洗液一并轉(zhuǎn)入刻度試管中。置沸水浴中加蓋煮沸10分鐘，冷卻后過濾，濾液收集于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。3.糖含量測(cè)定用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度試管中，加1ml水和0.5ml蒽酮試劑。再緩慢加入5ml濃H2SO4（注意：濃硫酸遇水會(huì)產(chǎn)生大量的熱！），蓋上試管

5、塞后，輕輕搖勻，再置沸水浴中10分鐘（比色空白用2ml蒸餾水與0.5ml蒽酮試劑混合，并一同于沸水浴保溫10分鐘）。冷卻至室溫后，在波長620nm下比色，記錄光密度值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量（g）。五、結(jié)果計(jì)算樣品含糖量（g/100g鮮重）=查表所得糖含量（g）×稀釋倍數(shù)×100/樣品重（g）×106六、注意事項(xiàng)（1）加濃H2SO4時(shí)應(yīng)緩慢加入，以免產(chǎn)生大量熱量而爆沸，灼傷皮膚，如出現(xiàn)上述情況，應(yīng)迅速用自來水沖洗。（2）水浴加熱時(shí)應(yīng)打開試管塞。實(shí)驗(yàn)（三） 維生素C的定量測(cè)定（2,6-二氯酚靛酚滴定法） 一、目的要求:（1）學(xué)習(xí)并掌握定量測(cè)定維生

6、素C的原理和方法。（2）了解蔬菜、水果中維生素C含量情況。二、實(shí)驗(yàn)原理: 維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時(shí)會(huì)產(chǎn)生壞血病，因此又稱為抗壞血酸（ascorbic acid）。它對(duì)物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。近年來，發(fā)現(xiàn)它還有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的抵抗力，并具有化學(xué)致癌物的阻斷作用。 維生素C是具有L系糖型的不飽和多羥基物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，植物的綠色部分及許多水果（如橘子、蘋果、草莓、山楂等）、蔬菜（黃瓜、洋白菜、西紅柿等）中的含量更為豐富。 維生素c具有很強(qiáng)的還原性。它可分為還原性和脫氫型。金屬銅和酶（抗壞血酸氧化酶）可以催化維生素C氧化為脫氫型。根據(jù)它具有還原性質(zhì)可測(cè)定

7、其金屬含量。 還原型抗壞血酸能還原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身則氧化為脫氫型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈紅色，還原后變?yōu)闊o色。因此，當(dāng)用此染料滴定含有維生素C的酸性溶液時(shí)，維生素C尚未全部被氧化前，則滴下的染料立即被還原成無色。一旦溶液中的維生素C已全部被氧化時(shí)，則滴下的染料立即使溶液變成粉紅色。所以，當(dāng)溶液從無色變成微紅色時(shí)即表示溶液中的維生素C剛剛?cè)勘谎趸?，此時(shí)即為滴定終點(diǎn)。如無其它雜質(zhì)干擾，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含還原型抗壞血酸量成正比。本法用于測(cè)定還原型抗壞血酸，總抗壞血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和熒光分光光度法測(cè)定。 三、試劑和器

8、材: （一）試劑2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸餾水中。1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸餾水中。標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液（1mg/ml）: 準(zhǔn)確稱取100mg純抗壞血酸（應(yīng)為潔白色，如變?yōu)辄S色則不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中，冷藏。最好臨用前配制。0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的熱水中，冷卻后加水稀釋至250ml，貯于棕色瓶中冷藏（4）約可保存一周。每次臨用時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液標(biāo)定。（二）材料辣椒、蘋果、卷心菜等。（三）器材錐形瓶（100ml），組織搗碎器，吸量管（10ml），漏

9、斗，濾紙，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。四、操作方法:1.提取水洗干凈整株新鮮蔬菜或整個(gè)新鮮水果，用紗布或吸水紙吸干表面水分。然后稱取20g，加入20ml 2%草酸，用研缽研磨，四層紗布過濾，濾液備用。紗布可用少量2%草酸洗幾次，合并濾液，濾液總體積定容至50ml。2.標(biāo)準(zhǔn)液滴定準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液1ml置100ml錐形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡紅色，并保持15s不褪色，即達(dá)終點(diǎn)。由所用染料的體積計(jì)算出1ml染料相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸（取10ml 1%草酸作空白對(duì)照，按以上方法滴定）。3.樣品滴定準(zhǔn)確吸取濾液兩

10、份，每份10ml, 分別放入2個(gè)錐形瓶內(nèi)，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白對(duì)照滴定。4.計(jì)算式中：VA為滴定樣品所耗用的染料的平均毫升數(shù)； VB為滴定空白對(duì)照所耗用的染料的平均毫升數(shù)； C為樣品提取液的總毫升數(shù)；D為滴定時(shí)所取的樣品提取液毫升數(shù)；T為1ml染料能氧化抗壞血酸毫克數(shù)（由操作二計(jì)算出）；W為待測(cè)樣品的重量（g）。五、注意事項(xiàng):1.某些水果、蔬菜（如橘子、西紅柿等）漿狀物泡沫太多，可加數(shù)滴丁醇或辛醇。2.整個(gè)操作過程要迅速，防止還原型抗壞血酸被氧化。滴定過程一般不超過2min。滴定所用的染料不應(yīng)小于1ml或多于4ml，如果樣品含維生素C太高或太低時(shí)，可酌情增減樣液用量或改變

11、提取液稀釋度。3.本實(shí)驗(yàn)必須在酸性條件下進(jìn)行。在此條件下，干擾物反應(yīng)進(jìn)行得很慢。4.2%草酸有抑制抗壞血酸氧化酶的作用，而1%草酸無此作用。5.干擾滴定因素有：若提取液中色素很多時(shí)，滴定不易看出顏色變化，可用白陶土脫色，或加1ml氯仿，到達(dá)終點(diǎn)時(shí)，氯仿層呈現(xiàn)淡紅色。Fe2可還原二氯酚靛酚。對(duì)含有大量Fe2的樣品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此時(shí)Fe2不會(huì)很快與染料起作用。樣品中可能有其它雜質(zhì)還原二氯酚靛酚，但反應(yīng)速度均較抗壞血酸慢，因而滴定開始時(shí)，染料要迅速加入，而后盡可能一點(diǎn)一點(diǎn)地加入，并要不斷地?fù)u動(dòng)三角瓶直至呈粉紅色，于15s內(nèi)不消退為終點(diǎn)。6.提取的漿狀物如不易過濾，亦可離心，留取上

12、清液進(jìn)行滴定。六、思考題：1為了測(cè)得準(zhǔn)確的維生素C含量，實(shí)驗(yàn)過程中都應(yīng)注意哪些操作步驟？為什么？2試簡述維生素C的生理意義。實(shí)驗(yàn)（四） 蛋白質(zhì)含量測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)G250法）一、目的1.學(xué)習(xí)一種蛋白質(zhì)染色測(cè)定的方法2.掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的基本原理和方法二、原理蛋白質(zhì)的存在影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在些基礎(chǔ)上發(fā)展了蛋白質(zhì)染色測(cè)定方法。涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍(lán)、溴甲酚綠和溴甲酚紫。目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍(lán)?？捡R斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中為棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合后，變?yōu)樗{(lán)色，且在蛋白質(zhì)一定濃度范圍內(nèi)符合比爾定律，可在5

13、95nm處比色測(cè)定。25分鐘即呈最大光吸收，至少穩(wěn)定1小時(shí)。在0.011.0 mg蛋白質(zhì)/ml范圍內(nèi)均可。該法操作簡便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質(zhì)之間差異大，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑時(shí)測(cè)定有干擾。緩沖液濃度過高時(shí)，改變測(cè)定液pH值會(huì)影響顯色?？捡R斯亮藍(lán)染色能力強(qiáng)，比色杯不洗干凈會(huì)影響光吸收值，不可用石英懷測(cè)定。三、器材與試劑1.儀器（1）分析天平；（2）具塞刻度試管10ml×8；（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I；（4）研缽；（5）漏斗；（6）離心管10ml；（7）

14、容量瓶10ml；（8）離心機(jī)；（9）721型分光光度計(jì)2.試劑 （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成 100 pgml的原液。 （2）考馬斯亮藍(lán)G250蛋白試劑 稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于50ml 90乙醇中，加入 85（mv）的磷酸 100ml，最后用蒸餾水定容到 1000ml。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。3.材料 植物種子四、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支具塞試管，編號(hào)后，按下表加入試劑。操作項(xiàng)目管 號(hào)1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸餾水(ml)1.0 0.8 0.6 0

15、.4 0.2 0G-250試劑(ml)各5蛋白質(zhì)含量（g）0 20 40 60 80 100 蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595 nm波長下比色測(cè)定（比色應(yīng)在 l h內(nèi)完成）。以牛血清白蛋白含量（g）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（1）準(zhǔn)確稱取約200mg綠豆芽下胚軸，放入研缽中，加入5ml蒸餾水在冰浴中研成勻漿，離心（4000rmin，10min），將上清液倒入10ml容量瓶，再向殘?jiān)屑尤?ml蒸餾水，懸浮后再離心10min，合并上清液，定至刻度。（2）另取1支具塞試管，準(zhǔn)確加入0.l ml樣品提取液，再加入0.9 ml蒸餾水，5ml考馬斯亮藍(lán)G2

16、50試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。3.結(jié)果處理根據(jù)所測(cè)樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（g），按下式計(jì)算： 樣品蛋白質(zhì)含量（gg鮮重）（查得的蛋白質(zhì)含量（g）×提取液總體積（ml）（樣品鮮重（g）×測(cè)定時(shí)取用提取液的體積（ml）六、注意事項(xiàng)1.由于染料本身的兩種顏色形式的光譜有重疊，試劑背景值會(huì)因與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料增加而不斷降低，因而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較大時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線稍有彎曲，但直線彎曲程度很輕，不致影響測(cè)定2.測(cè)定工作應(yīng)在蛋白質(zhì)染料混合后2min開始，力爭1hr內(nèi)完成，否則會(huì)因蛋白質(zhì)一染料復(fù)合

17、物發(fā)生凝集沉淀而影響測(cè)定結(jié)果。3.樣品中的Tris、乙酸、2-巰基乙醇、EDTA等物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有少量顏色干擾，可以在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)可以用緩沖液代替蒸餾水，就可以將干擾扣除，（五）有機(jī)酸含量的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握強(qiáng)堿滴定弱酸的基本原理和指示劑的選擇；2.學(xué)會(huì)有機(jī)酸含量的測(cè)定方法；3.進(jìn)一步熟練滴定操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理大多數(shù)有機(jī)酸是弱酸，如果某有機(jī)酸易溶于水，解離常數(shù)10-7，用標(biāo)準(zhǔn)堿可以直接測(cè)其含量，反應(yīng)產(chǎn)物為強(qiáng)堿弱酸鹽。本實(shí)驗(yàn)我們選用的有機(jī)酸是苯甲酸，其解離常數(shù)Ka為6.2×10-5，若CspKa10-8采用指示劑判斷終點(diǎn)時(shí),直接準(zhǔn)確滴定某一元弱酸的可行性判據(jù)。Csp是計(jì)量點(diǎn)時(shí)體積計(jì)算被滴定物質(zhì)的分析濃度。如果我們配制的苯甲酸濃度不是特別小，就可以用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液直接測(cè)定其含量，計(jì)量點(diǎn)時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物為強(qiáng)堿弱酸鹽，滴定突躍在堿性范圍內(nèi)，可以選用酚酞指示劑，滴定溶液由無色變?yōu)槲⒓t色即為終點(diǎn)。根據(jù)N