硝酸還原酶的測定

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆阵w內(nèi)法測定植物組織中的硝酸還原酶原理和方法,二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理硝酸還原酶（NR是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，還原為亞硝酸鹽:no3明確誘導(dǎo)酶含義。與作物吸收和利用氮肥有關(guān)。它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽+ NADH + H+ NO2 +NAD+ + H30產(chǎn)生的NO-可以從組織內(nèi)滲透到外界溶液中，并積累在溶液中，測定NO-含量的增加，即表示該酶活性的大小。NO-含量的測定用磺胺比色法。在酸性溶液中產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對-氨基苯磺酸（或?qū)?氨基苯磺酰胺）反應(yīng)產(chǎn)生重氮，再與 a -萘胺（或萘基乙烯二胺）偶聯(lián)形成紫紅色的偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在540nm波長下有最大吸收峰，可用分光光度

2、法測定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定溶液中NO2-含 量。三、主要儀器設(shè)備1、實(shí)驗(yàn)儀器2、實(shí)驗(yàn)試劑3、實(shí)驗(yàn)材料 處理。分光光度計，真空泵，溫箱，天平，0.1moI/L pH7.5的磷酸緩沖液，對-氨基苯磺酸溶液, 在15-25 C蒸餾水培養(yǎng)一周的大麥苗兩組，一組加2個燒杯，移液管若干，試管 3支，剪刀。 a萘胺溶液，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液KNO3，一組加NH4CI，在白天置光照下四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1、 剪取新鮮的葉片兩組，一組是處理苗0.51g，另一組是對照苗 實(shí)。2、兩組中各加入15ml的酶促反應(yīng)液。3、真空抽取10min，充分交換細(xì)胞內(nèi)外液。4、加蓋在30 C的保溫箱中保溫 20min。5、 去除材料，用

3、移液管取4ml反應(yīng)液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置6、比色：在540nm的波長下分光光度測定亞硝酸的7、空白管：4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液 測定亞硝酸的OD值。0.50g ,OD值。2ml室溫放置15min葉片各剪為0.51cm的碎片，壓15min。同樣在540nm的波長下分光光度五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理稱重： 處理苗0.51g;對照苗0.50gOD值：處理苗 0.513A ;對照苗0.050ANO-含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=257.29X-4.8262 （X=OD 值；Y=NO2 含量（nmol）對照苗:有標(biāo)準(zhǔn)曲線得出 NO-的含量：處理苗：C NO-=127.16nmo

4、l 硝酸還原酶活力（nmol NO 2- g-1 h-1）=根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的NO2硝酸還原酶活力：處理苗 =2805 nmol NQ- g-1 h-1CNO2-=8.038nmlo(nmol) x 3 x 15/4/m對照苗=180.855 nmol NO 2g 1 h 1六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)表明用硝酸鉀處理的苗比用氯化銨處理的苗硝酸還原酶活力更強(qiáng)，而且根據(jù)測出的亞硝酸的含量，處理苗是對照苗的 10 倍左右，遠(yuǎn)比旁邊幾組的高，因?yàn)榭赡苁且驗(yàn)樵谌〔牡臅r候，取了粘有培養(yǎng)液的根部，但并沒有用蒸餾水洗去吸附在上面的硝酸根、亞硝酸根，或者根部的硝酸還原酶活 性更多（猜測）

5、。2、誘導(dǎo)時如用 NaN03替代KN03吉果會如何，為什么？光合呼吸作用減弱，酶的活力降低，從而影響硝酸根轉(zhuǎn)化為亞硝酸根，實(shí)驗(yàn)中可能兩組紫紅色的顏色差別很小，使測得的還原酶活力偏低。原因：K+離子可以調(diào)節(jié)滲透勢，氣孔開閉，促進(jìn)氧化磷酸化，另外鉀活化呼吸作用和光合作用的酶的活性，是 40多種酶的輔助因子， 是形成細(xì)胞膨脹和維持細(xì)胞內(nèi)電中性的主要陽離子。 而 Na 離子雖然可以部分地代替鉀的作用，但不能完全替代。3、如不進(jìn)行光照，吉果會怎么樣，為什么？吉果可能是兩組的實(shí)驗(yàn)吉果相差不大，而且所測定的還原酶的活力都很低。原因：之前的呼吸作用已經(jīng)消耗大量的糖類，而在沒有光合作用的條件下，苗儲存的糖類很少

6、，所以呼吸作用會大大減弱，使酶活力比預(yù)期吉果低，兩組亞硝酸鹽含量相差不多。4、亞硝酸是過多施用氮肥后蔬菜中積累的致癌物質(zhì)，請根據(jù)本實(shí)驗(yàn)寫出簡易測定蔬菜亞硝酸含量的方法。取新鮮蔬菜的組織，用酶促反應(yīng)液浸提， 取適量的反應(yīng)液加磺胺加 a萘胺，靜置后用分光光度計測定， 然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出相應(yīng)的亞硝酸的含量。七、討論、心得 2、選用同一植株的不同部位，所得的吉果會不同，因此在取材的時候要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，認(rèn)真選取，以 免照成實(shí)驗(yàn)的失敗，但是在課后你可以根據(jù)自己的加假設(shè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察是不是由于這個原因?qū)е铝四銓?shí) 驗(yàn)上的誤差。另外，酶促反應(yīng)在暗條件下進(jìn)行，以防止葉綠素形成還原型鐵氧化蛋白，促進(jìn)亞硝酸還原酶 把亞硝酸還原成氨氣。4、硝酸還原酶，是硝酸鹽同化中第一個酶，也是限速酶，催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，在植 物的氮素代謝過程中發(fā)揮重要作用，與作物有效吸收和利用氮素肥料有關(guān)，對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影 響，硝酸鹽還原酶活性被當(dāng)作植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一。而現(xiàn)在大 部分地區(qū)農(nóng)業(yè)還很落后，