熒光分光光度計(jì)-原理

1、分子熒光分析法基本要點(diǎn)：1. 理解分子熒光法的基本原理；2. 掌握分子熒光發(fā)射光譜的特；3. 了解熒光光譜儀的組成及各部分作用；4. 掌握分子熒光分析法的定量分析方法及主要應(yīng)用范圍。發(fā)光光譜：物質(zhì)分子或原子吸收輻射被激發(fā)后，電子以無輻射躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再以輻射的方式釋放這一部分能量而產(chǎn)生的光譜稱為 熒光、磷光。 根據(jù)物質(zhì)接受的輻射能量的大小及與輻射作用的質(zhì)點(diǎn)不同，熒光分析法可分為以下幾種：1. X 射線熒光分析法 用 X 射線作光源，待測(cè)物質(zhì)的原子受激發(fā)后在很短時(shí)間內(nèi)（10-8 s）發(fā)射波長(zhǎng)在 X 射線范圍內(nèi)的熒光。2. 原子熒光分析法： 待測(cè)元素的原子蒸氣吸收輻射激發(fā)后，

2、在很短的時(shí)間內(nèi)（10-8 s），部分將發(fā)生輻射躍遷至基態(tài)，這種二次輻射即為熒光，根據(jù)其波長(zhǎng)可進(jìn)行定性，根據(jù)譜線強(qiáng)度進(jìn)行定量。 熒光的波長(zhǎng)如與激發(fā)光相同，稱為共振熒光。 熒光的波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)，稱為stokes熒光；若短，稱為反stokes熒光。3. 分子熒光分析法： 有些物質(zhì)的多原子分子，在用紫外、可見光（或紅外光）照射時(shí)，也能發(fā)射波長(zhǎng)在紫外、可見（紅外）區(qū)熒光，根據(jù)其波長(zhǎng)及強(qiáng)度可進(jìn)行定性和定量分析，這就是通常的（分子）熒光分析法。· 基本原理一. 分子熒光的發(fā)生過程（一）分子的激發(fā)態(tài)單線激發(fā)態(tài)和三線激發(fā)態(tài) 大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，在基態(tài)時(shí)，這些電子成對(duì)地存在于各個(gè)原子或分子軌道中

3、，成對(duì)自旋，方向相反，電子凈自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性 M=2S+1=1 (M 為磁量子數(shù))，因此，分子是抗（反）磁性的，其能級(jí)不受外界磁場(chǎng)影響而分裂，稱“單線態(tài)”；圖1 單線基態(tài)（A）、單線激發(fā)態(tài)（B）和三線激發(fā)態(tài)（C） 當(dāng)基態(tài)分子的一個(gè)成對(duì)電子吸收光輻射后，被激發(fā)躍遷到能量較高的軌道上，通常它的自旋方向不改變，即ÄS=0，則激發(fā)態(tài)仍是單線態(tài)，即“單線(重)激發(fā)態(tài)”； 如果電子在躍遷過程中，還伴隨著自旋方向的改變，這時(shí)便具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，電子凈自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁場(chǎng)中受

4、到影響而產(chǎn)生能級(jí)分裂，這種受激態(tài)稱為“三線(重)激發(fā)態(tài)”；“三線激發(fā)態(tài)” 比 “單線激發(fā)態(tài)” 能量稍低。但由于電子自旋方向的改變?cè)诠庾V學(xué)上一般是禁阻的，即躍遷幾率非常小，只相當(dāng)于單線態(tài) 單線態(tài)過程的 10-610-7。（二）分子去活化過程及熒光的發(fā)生： （一個(gè)分子的外層電子能級(jí)包括 S0（基態(tài)）和各激發(fā)態(tài)S1，S2，.，T1.，每個(gè)電子能級(jí)又包括一系列能量非常接近的振動(dòng)能級(jí)） 處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，在較短的時(shí)間內(nèi)可通過不同途徑釋放多余的能量（輻射或非輻射躍遷）回到激態(tài)，這個(gè)過程稱為“去活化過程”，這些途徑為：1. 振動(dòng)弛豫：在溶液中，處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞，把一部分能量以熱

5、的形式迅速傳遞給溶劑分子（環(huán)境），在10-1110-13 秒時(shí)間回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，這一過程稱為振動(dòng)弛豫。圖2 分子吸收和發(fā)射過程的能級(jí)圖2. 內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)激發(fā)態(tài)S2 的較低振動(dòng)能級(jí)與S1 的較高振動(dòng)能級(jí)的能量相當(dāng)或重疊時(shí)，分子有可能從S2 的振動(dòng)能級(jí)以無輻射方式過渡到S1 的能量相等的振動(dòng)能級(jí)上， 這一無輻射過程稱為“內(nèi)轉(zhuǎn)換”。 （“ 內(nèi)轉(zhuǎn)換”過程同樣也發(fā)生在三線激發(fā)態(tài)的電子能級(jí)間） 3. 外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用（如碰撞）而以非輻射形式轉(zhuǎn)移掉能量回到基態(tài)的過程稱“外轉(zhuǎn)換” 。4.系間跨躍：當(dāng)電子單線激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)與電子三線激發(fā)態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)相重

6、疊時(shí)，發(fā)生電子自旋狀態(tài)改變的 ST 躍遷，這一過程稱為 “系間跨躍” 。 （含有高原子序數(shù)的原子如 Br2、I2 的分子中，由于分子軌道相互作用大，此過程最為常見。）5. 熒光發(fā)射：當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫到達(dá)第一單線激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)時(shí)，第一單線激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子可通過發(fā)射輻射（光子）躍回到基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)，此過程稱為 “熒光發(fā)射”。 如果熒光幾率較高，則發(fā)射過程較快，需10-8秒。（它代表熒光的壽命）由于不同電子激發(fā)態(tài)（S）的不同振動(dòng)能級(jí)相重疊時(shí)，內(nèi)轉(zhuǎn)換發(fā)生速度很快（容易），在10-111013秒內(nèi)完成，所以通過重疊的振動(dòng)能級(jí)發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的幾率要比由高激發(fā)態(tài)發(fā)射熒光

7、的幾率大的多，因此，盡管使分子激發(fā)的波長(zhǎng)有短（l1）有長(zhǎng)（ l2 ），但發(fā)射熒光的波長(zhǎng)只有l(wèi)3（>l1>l2）。6. 磷光發(fā)射：第一電子三線激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子以發(fā)射輻射（光子）的形式回到基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)，此過程稱為 “磷光發(fā)射”。 （磷光的波長(zhǎng)l4較熒光的波長(zhǎng)l3稍長(zhǎng)，發(fā)生過程較慢 約 10-410s） 由于三線態(tài) 單線態(tài)的躍遷是禁阻的，三線態(tài)壽命比較長(zhǎng)，（10-310s 左右），若沒其它過程同它競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，磷光的發(fā)生就有可能；由于三線態(tài)壽命較長(zhǎng)，因而發(fā)生振動(dòng)弛豫及外轉(zhuǎn)換的幾率也高，失去激發(fā)能的可能性大，以致在室溫條件下很難觀察到溶液中的磷光現(xiàn)象。因此，試樣采用液氮冷凍降低其它

8、去活化才能觀察到某些分子的磷光。 總之：處于激發(fā)態(tài)的分子，可以通過上述不同途徑回到基態(tài)，哪種途徑的速度快，哪種途徑就優(yōu)先發(fā)生。 如果發(fā)射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比 較快，則熒光發(fā)生幾率高，強(qiáng)度大。 如果發(fā)射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比 較慢，則熒光很弱或不發(fā)生。（三）熒光量子效率：物質(zhì)發(fā)射熒光的光子數(shù)與吸收激發(fā)光的光子數(shù)的比值。 (1) F 數(shù)值在 01 之間。他的大小取決于物質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及環(huán)境（t0c、pH 、溶劑等）。 二. 激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜1. 激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長(zhǎng)，固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定不同波長(zhǎng)激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)

9、射的熒光強(qiáng)度(F)，作Fl光譜圖稱激發(fā)光譜。 從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長(zhǎng)lex，選用 lex可得到強(qiáng)度最大的熒光。2. 熒光光譜：選擇lex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光，記錄每一波長(zhǎng)下的 F，作 F- l 光譜圖稱為熒光光譜。 熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長(zhǎng)為 lem 。lex 與 lem一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長(zhǎng)。 三. 熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 1. 分子結(jié)構(gòu)與熒光 具有 p、 p 及 n、 p 電子共軛結(jié)構(gòu)的分子能吸收紫外和可見輻射而發(fā)生 p -p* 或 n - p* 躍遷，然后在受激分子的去活化過程中發(fā)生 p*- p或 p*- n 躍遷而發(fā)射熒光

10、。 發(fā)生 p - p* 躍遷分子，其摩爾吸光系數(shù)（å）比 n - p* 躍遷分子的大1001000倍，它的激發(fā)單線態(tài)與三線態(tài)間的能量差別比 n - p* 的大的多，電子不易形成自旋反轉(zhuǎn)，體系間跨越幾率很小，因此， p - p* 躍遷的分子，發(fā)生熒光的量子效率高，速率常數(shù)大，熒光也強(qiáng)。 所以只有那些具有 p- p 共軛雙鍵的分子才能發(fā)射較強(qiáng)的熒光； p 電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度就越大（ lex與 lem長(zhǎng)移）大多數(shù)含芳香環(huán)、雜環(huán)的化合物能發(fā)出熒光，且 p 電子共軛越長(zhǎng)， F 越大。 2. 取代基對(duì)分子發(fā)射熒光的影響（1）（苯環(huán)上）取代 給電子基團(tuán)，使 p 共軛程度升高à熒光

11、強(qiáng)度增加：如CH3，NH2 ，OH ，OR等。（2） (苯環(huán)上）取代吸電子基團(tuán)，時(shí)熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅：如： ，COOH ，CHO， NO2 ，N=N。（3）高原子序數(shù)原子，增加體系間跨越的發(fā)生，使熒光減弱甚至熄滅。如：Br，I 。3. 共面性高的剛性多環(huán)不飽和結(jié)高的分子有利于熒光的發(fā)射。例如：熒光素呈平面構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)具有剛性，它是強(qiáng)熒光物質(zhì)；而酚酞分子由于不易保持平面結(jié)構(gòu)，故而不是熒光物質(zhì)。· 溶液的熒光強(qiáng)度一.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 熒光是由物質(zhì)吸收光能后發(fā)射而出，因此，溶液的熒光強(qiáng)度 F 和溶液吸收光能的程度以及物質(zhì)的熒光頻率有關(guān)： F （I0-It） F = K（I0-It

12、） (2) K 為常數(shù)，取決于熒光物質(zhì)的量子效率F，根據(jù)LB定律： 所以 F = K ( I0-I010-ebc) = K I0 ( 1-10-ebc) = K I0 ( 1-e-2.303ebc ) (3) 將式中 e-2.303ebc 展開，得 (4) 當(dāng) 2.303ebC£ 0.05 時(shí)(濃度很小，溶液較稀時(shí))，上式括號(hào)內(nèi)第一項(xiàng)以后的各項(xiàng)均可忽略不計(jì)，所以： F = KI02.303ebc （5） 對(duì)于一熒光物質(zhì)的稀溶液，當(dāng) I0 及 b 一定時(shí)，F(xiàn) = K·c （6） 即在低濃度（2.303ebc £ 0.05）時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈（線性）

13、正比關(guān)系。二. 定量分析方法 1. 工作曲線法： 配制一系列濃度梯度的待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同空白溶液，使樣經(jīng)過相同的處理之后分別測(cè)定熒光強(qiáng)度：Fs、F0、Fx，然后作（ Fs - F0） c 曲線，根據(jù)（FxF0)，從工作曲線上求得待測(cè)物的濃度（或含量）。 2. 直接比較法 ： 如果熒光物質(zhì)溶液的工作曲線通過原點(diǎn)，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進(jìn)行測(cè)定： Fs¯F0 = KcS ， Fx¯F0 = Kcx （7）三. 影響熒光強(qiáng)度的外界因素 1. 激發(fā)光源：一般選用lex 最大 但對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(zhǎng)波長(zhǎng)，低 I0 及短時(shí)間光照 2. 溫度：大多數(shù)分子

14、在溫度升高時(shí)，分子與分子之間，分子與溶劑分子之間的碰撞頻率升高，非輻射能量轉(zhuǎn)移過程升高，F(xiàn) 降低，因此，降低溫度，有利于提高 F 。 3. 溶液的 pH：帶有酸性或堿性環(huán)狀取代基的芳香組化合物的熒光一般都與 pH 值有關(guān)，有些化合物在離子狀態(tài)時(shí)不顯熒光。為此，在用熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，嚴(yán)格控制溶液 pH值是非常重要的。4. 溶劑：對(duì)共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，E 減小 躍遷幾率升高 F（波長(zhǎng)長(zhǎng)移）溶劑粘度 F5. 內(nèi)濾：當(dāng)熒光波長(zhǎng)與熒光物質(zhì)或其它物質(zhì)的吸收峰相重疊時(shí)，將發(fā)生自吸收使熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度下降，此現(xiàn)象稱 “內(nèi)濾” 。6. 散射光的影響（溶劑的二種散射）（1）瑞利散射光：物質(zhì)（溶劑或

15、其它分子）分子吸收光能后，躍遷到基態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)，在極短時(shí)間（10-12s）返回到原來的振動(dòng)能級(jí)并發(fā)出和原來吸收光相同波長(zhǎng)的光，這種光稱為瑞利散射光。（2）拉曼散射光：物質(zhì)分子吸收光能后，若電子返回到比原來能極稍高（或稍低）的振動(dòng)能級(jí)而發(fā)射的光稱為拉曼散射光。 瑞利散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同，拉曼散射與激發(fā)光波長(zhǎng)不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)無關(guān)，因此可以通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)將拉曼散射光與熒光分開。7. 熒光熄滅劑的影響： 熒光熄滅：熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。 熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如：X-，重金屬離子、O2 、硝基化物質(zhì)、重氮化合物

16、等。 尤其是溶液中的溶解氧能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴(yán)格的熒光實(shí)驗(yàn)中必須除O2 。8. 表面活性劑的影響：提高熒光強(qiáng)度。· 測(cè)量熒光的儀器 熒光計(jì)、熒光分光光度計(jì)的基本組成部件：激發(fā)光源、樣品池、單色器、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)。1. 激發(fā)光源：要比吸收法中光源強(qiáng)度大。 汞燈：提供線光譜（光源強(qiáng)度隨l變化大） 碘鎢燈：提供連續(xù)光譜 300700nm. 氙燈：提供連續(xù)光譜250700nm，300400nm 段強(qiáng)度相近。 激光：發(fā)光強(qiáng)度大，能極大地提高熒光分析的靈敏度。2. 樣品池：通常用石英材料制成長(zhǎng)方體形（方形），（散射光較少），低溫?zé)晒鉁y(cè)定時(shí)在一樣品池外

17、套一個(gè)液氮的透明石英真空瓶。3. 單色器：熒光計(jì)兩個(gè)濾光片。 第一濾光片：在光源與樣品池之間，濾去不需要的光讓需要的激發(fā)光通過。 第二濾光片：在樣品池與檢測(cè)器之間，濾去溶劑散射光，容器表面散射光，雜質(zhì)發(fā)出的光等，讓待測(cè)物質(zhì)發(fā)射的熒光通過。熒光分光光度計(jì)兩個(gè)光柵（位置同濾光片）單色性好。4. 檢測(cè)器：因熒光通常較弱，采用光電倍增管作檢測(cè)器，靈敏度高。5. 顯示系統(tǒng)：光度表、計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)等· 應(yīng)用與示例一.無機(jī)化合物的熒光分析 無機(jī)化合物除了鈉鹽等少數(shù)例外，一般不顯示熒光。但很多金屬或非金屬離子可以與一有p電子共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物形成有熒光的化合物后，用熒光法測(cè)定： 1. 直接分析法：

18、形成配（鰲）合物 元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sn、Si、Ta (鉭)、Th(釷)、Te、W、Zn、Zr 等。常用有機(jī)熒光試劑：8-羥基喹啉，安息香、茜素紫醬R，黃酮醇，二苯乙醇酮等。二. 有機(jī)化合物的熒光分析 熒光分析法主要應(yīng)用于有機(jī)物、生化物質(zhì)、藥物的測(cè)定（200多種）；包括有機(jī)化合物如：多環(huán)胺類、萘酚類、吲哚類、多環(huán)芳烴、氨基酸、蛋白質(zhì)等。 藥物如：?jiǎn)岱?、喹啉類、異喹啉類、麥角堿、麻黃堿 等。 維生素如：維生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、葉酸 等。甾體、抗生素、酶、輔酶 等。 常見熒光試劑：熒胺 脂肪族或芳香族伯胺類； 鄰苯二甲醛(OPA)