高效液相色譜儀使用注意事項(xiàng)[1]

1、島津液相色譜儀使用注意事項(xiàng)     1.流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過濾)。      2.流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。     3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。     4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿

2、外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。     5.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L霉。     6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。     7.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。     8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過濾器管路過濾器單向閥檢查并清洗。清洗方法；以異丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清洗；用1

3、0稀硝酸清洗。     9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。     10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。     11.要注意柱子的pH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。     12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過渡一下。液相色譜柱使用經(jīng)驗(yàn)談色譜柱在使用前，最好進(jìn)

4、行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。    1、樣品的前處理：     a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。     b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。     c、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒

5、雜質(zhì)。 流動(dòng)相的配制液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：     a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。     b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。     c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。    &

6、#160;d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。     e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。     f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。   3、流動(dòng)相流速的選擇： 因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇

7、1mlmin，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mlmin為佳。 當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。 注意：     a由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。     b對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。    &

8、#160;c含水流動(dòng)相最好在臨實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。     d流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。     e使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能常見故障的斷定及解決方法診狀可能的原因及解決方法      (一)保留時(shí)間變化          1.柱溫變化 柱恒溫

9、，必要時(shí)需配置恒溫箱         2.等度與梯度間未能充分平衡 至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱         3.緩沖液容量不夠用 25mmol/L的緩沖液         4.柱污染 每天沖洗柱         5.柱內(nèi)條件變化 穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相 &#

10、160;       6.柱快達(dá)到壽命 采用保護(hù)柱     (二)保留時(shí)間縮短         1.流速增加 檢查泵,重新設(shè)定流速        2.樣品超載 降低樣品量        3.鍵合相流失 流動(dòng)相pH值保持在37.5，檢查柱的方向 

11、60;      4.流動(dòng)相組成變化 防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀        5.溫度增加 柱恒溫      (三)保留時(shí)間延長         1.流速下降 管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡        2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化 用流動(dòng)相

12、改性劑,如加三乙胺,或采用堿質(zhì)鈍化柱        3.鍵合相流失 同前(二)3        4.流動(dòng)相組成變化 同前(二)4       5.溫度降低 同前(二)5     (四) 出現(xiàn)肩峰或分叉        1.樣品體積過大 用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積

13、小于第一峰的15%        2.樣品溶劑過強(qiáng) 采用較弱的樣品溶劑        3.柱塌陷或形成短路通道 更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件        4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品        5.進(jìn)樣器損壞 更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子 &

14、#160;   (五)鬼峰        1.進(jìn)樣閥殘余峰 每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗        2.樣品中未知物 處理樣品        3.柱未平衡 重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑 (尤其是離子對(duì)色譜)        4.三氟乙酸(TF

15、A)氧化(肽譜) 每天新配,用抗氧化劑        5.水污染(反相) 通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水     (六) 基線噪聲         1.氣泡(尖銳峰) 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓        2.污染(隨機(jī)噪聲) 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑   

16、0;    3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲 更換氘燈        4.電干擾(偶然噪聲) 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)        5.檢測(cè)器中有氣泡 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓     (七)峰拖尾         1.柱超載 降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相

17、60;       2.峰干擾 清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相        3.硅羥基作用 加三乙胺,用堿質(zhì)鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度，降低流動(dòng)相pH值，鈍化樣品        4.同前(四)4 同前(四)4        5.同前(四)3 5.同前(四)3   &

18、#160;    6.死體積或柱外體積過大 連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管        7.柱效下降 用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱      (八)峰展寬         1.進(jìn)樣體積過大 同(四)1        2

19、.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展 進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散        3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)        4.檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過大 設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%        5.流動(dòng)相粘度過高 增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相        6.檢

20、測(cè)池體積過大 用小體積池,卸下熱交換器        7.保留時(shí)間過長 等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫        8.柱外體積過大 將連接管徑和連接管長度降至最小        9.樣品過載 進(jìn)小濃度小體積樣品液相色譜儀使用操作規(guī)程液相色譜儀使用操作規(guī)程總流程：    超純水沖洗柱流動(dòng)相分離樣品超純水沖洗柱

21、純乙睛保存柱1 電源準(zhǔn)備 打開穩(wěn)壓器電源開關(guān)，須待電壓指示至 220V 后，才能開啟其他有關(guān)設(shè)備。2 HP1100 高效液相色譜儀的準(zhǔn)備          試劑：三氟乙酸      乙腈(Fisher 公司產(chǎn)品色譜純)    超純水(Millipore 超純水)    冰乙酸    溶液配置：貯液瓶與流動(dòng)相的準(zhǔn)備

22、60;   A 液 0.1%三氟乙酸 （三氟乙酸 1ml，超純水 999ml）室溫保存    B 液 60%乙腈 （乙腈 600ml， 超純水 400ml）室溫保存    樣品液 0.01%乙酸 （冰乙酸0.01ml，超純水 100ml）室溫保存     泵頭沖洗液：精濾后超純水或者是 1%色譜純甲醇 室溫保存    注：貯液瓶應(yīng)用超純水清洗干凈，備用。    流動(dòng)相

23、溶劑用潔凈硼砂漏斗精濾除去微小顆粒。      操作者必須清楚并注明 A、B 貯液瓶盛裝為何種溶劑。    沖 洗 泵 頭 ： 用 注 射 管 于 軟 塑 料 管 末 端 抽 吸 至 有 水 流 出 ， 調(diào) 節(jié) 流 速 開 關(guān) 控 制 流 速 為20-30drop/min.。     流動(dòng)相管道排氣    如果管道中氣泡較多，可通過彈擊管道，排除氣泡，并逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)脫氣泵活塞使其松動(dòng)，用注射管于流動(dòng)相出口的塑料管末端抽

24、吸至管道內(nèi)氣泡排除完全。操作時(shí)，我們通常已經(jīng)打開了脫氣機(jī)（氣泡嚴(yán)重影響分離效果，所以觀察管道中液體是否有氣泡非常重要。）     開機(jī)     進(jìn)入 HP1100 操作系統(tǒng)     a.雙擊 WIN-95 操作界面中左下角 Instrument 1 online 圖標(biāo)，進(jìn)入 HP1100 工作站軟件操作界面。單擊工作站操作界面上方 Run control 菜單，在下拉菜單中找到 Sample Info 子菜單，單擊。在 Sample Info 信息框內(nèi)定義操作者、樣品前綴及編

25、號(hào)、保存路徑等參數(shù)。在保存路徑項(xiàng)下，將可定義子目錄分別輸入操作者拼音縮寫，以方便檢索時(shí)互不干擾。    b.等待工作站操作界面中泵、柱溫箱、檢測(cè)器各指示圖標(biāo)由灰色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色后，單擊泵、檢測(cè)器各圖標(biāo)可從其各自彈出的菜單中設(shè)定流動(dòng)相各溶劑比例、流速等。     （1） 流速通常為 1ml/min。檢測(cè)波長通常為 280，或者 254nm。     （2） A 液設(shè)置為 100%，運(yùn)行 15-30 分鐘（目的是色譜柱的預(yù)平衡），觀察基線走勢(shì)，基線應(yīng)為直線，通過單擊“Balance”

26、鍵可將基線調(diào)至零點(diǎn)。待基線平穩(wěn)后可進(jìn)樣。       （3） 調(diào)整 A 液為 0，B 液為 100%再運(yùn)行 60 分鐘（此時(shí)乙腈實(shí)際濃度為 60%）     （4） 在 A 液沖洗同時(shí)進(jìn)行進(jìn)樣環(huán)的沖洗：用 500l 的針樣注射器，在 load 狀態(tài)，注入超純水 500l。（反復(fù)三次，若是 20l 進(jìn)樣環(huán)，則加入 20l 以上，多余的水可廢液管流出。通常同一樣品上樣 30 次后應(yīng)沖洗進(jìn)樣環(huán)，如果不同樣品，最好，每次上樣前均進(jìn)行沖洗。）      （5） 吸取

27、一定量可直接進(jìn)樣的樣品溶液（上樣液最好用濾器濾過），將進(jìn)樣閥逆時(shí)針旋至Load 檔，將進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔處水平推入，按進(jìn)樣器活塞將樣品溶液注射入進(jìn)樣環(huán)后，立即將進(jìn)樣閥順時(shí)針方向旋至 Inject 檔，與此同時(shí)，數(shù)據(jù)開始自動(dòng)收集。     （6） 此時(shí)樣品分析已經(jīng)完成。在 HP1100 主操作界面的檢測(cè)器圖標(biāo)，關(guān)閉檢測(cè)器，然后關(guān)閉色譜儀主機(jī)檢測(cè)器開關(guān)（目的是延長檢測(cè)器壽命）。將 B 通道調(diào)為 0，A 通道調(diào)為 100%，即 A 液沖洗色譜柱約 10-30min。用 A 液續(xù)沖洗色譜柱約 10-30m（目的是沖出柱內(nèi)殘留的雜質(zhì)）   

28、;  （7） A 通道換為 C 通道（100%乙腈）續(xù)沖洗色柱約 10-30min。（目的主要為保護(hù)柱）     數(shù)據(jù)記錄的終止與保存    電腦將自動(dòng)收集并保存數(shù)據(jù)，終止運(yùn)行后，將自動(dòng)彈出數(shù)據(jù)框，或者可通過 DATA ANALYSIS菜單，調(diào)出資料。  3 圖譜處理4 關(guān)機(jī)    1） HP1100 的關(guān)閉     在 HP1100 的主操作界面上分別單擊關(guān)閉泵、檢測(cè)器圖標(biāo)，或通過菜單關(guān)閉 。然后，單擊H

29、P1100 的主操作界面右上方“X”，退出 Instrument 1 online 程序，返回至 WIN-95 操作界面。單擊左下角“Start”菜單，單擊“Shut down”,等待關(guān)機(jī)，待出現(xiàn)“Restart”提示后，按電腦主機(jī)電源鍵，關(guān)閉電腦主機(jī)及顯示器。將所有使用儀器用布蓋好。關(guān)閉排氣扇、空調(diào)與穩(wěn)壓器開關(guān)。    2） 清潔衛(wèi)生     實(shí)驗(yàn)完畢后，打掃儀器室桌面與地面清潔，保持桌面整潔。    3） 儀器使用記錄     記錄

30、當(dāng)天的儀器使用情況于指定記錄本上，包括儀器使用起止時(shí)間與出現(xiàn)問題的解決方案，并簽上操作者的名字.液相色譜儀使用及維護(hù)方法     液相色譜儀使用時(shí)要非常注意。     使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來，否則會(huì)造成填料的流失。      液相色譜柱使用注意：     卡套柱的安裝（加預(yù)柱）        

31、  1將卡套架套入柱芯     2將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯（見下圖）     3將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片     4將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)     5將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊     6然后依同樣的順序連接好柱子的另一端        

32、60; 平衡色譜柱           反相色譜柱在經(jīng)過出廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。請(qǐng)一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用1020倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。      硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測(cè)試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡  

33、        如何平衡色譜柱？     平衡過程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑度如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）          色譜柱的再生      進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。         &#

34、160; 注意：          在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。          色譜柱的維護(hù)      1使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度） &

35、#160;   2大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍      3避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化     4流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理     5如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇/乙腈中      6壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)液相色譜的常用術(shù)語1、色譜曲線chromatogram）：在色譜法中，當(dāng)樣品加入后，樣品中各組分隨著流動(dòng)

36、相的不斷向前移動(dòng)而在兩相間反復(fù)進(jìn)行溶解、揮發(fā)，或 吸附、解吸的過程。如果各組分在固定相中的分配系數(shù)（表示溶解或吸附的能力）不同，就有可能達(dá)到分離。分配系數(shù)小的組分滯留在固定相中的時(shí)間短，在柱內(nèi)移動(dòng)的速度快，先流出柱子；分配系數(shù)大的組分滯留在固定相中的時(shí)間長，在柱內(nèi)移動(dòng)的速度慢，后流出柱子；分離后的各組分經(jīng)檢測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)而記錄下來，得到一條信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線，稱為色譜流出曲線或 “色譜峰”，理想的色譜流出曲線應(yīng)該是正態(tài)分布曲線。2、（色譜）峰（chromatographic peak）：色譜柱流出組分通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。3、峰底（peak base）：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)

37、之間的連接的直線。4、峰高（h ，peak height）：色譜峰最大值點(diǎn)到峰底的距離。5、峰寬（W ，peak width）：在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)的距離。6、半高峰寬（W h/2 ，peak withd at half height）：通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離（圖1 中的HJ）。7、峰面積（A ，peak area）：峰與峰底之間的面積（圖1中的CHEJDC）。8、拖尾峰（tailing peak）：后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰。9、前伸峰（leading peak）：前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（gho

38、st peak）：除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來誤差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrorted peak）：形狀不對(duì)稱的色譜峰， 前伸峰、拖尾峰都屬于這類。 12、反峰（negative peak）：也稱倒峰、負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)(推薦)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱

39、從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在

40、進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃

41、與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼勺將柱頭填料取出12mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。 通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在p