制藥用水微生物限度檢驗方法學(xué)確認(rèn)20111

1、制藥用水-微生物限度檢驗方法學(xué)確認(rèn)目錄一、引言1、概述2、驗證的目的二、驗證方法合格標(biāo)準(zhǔn)三、主要材料確認(rèn)1、儀器設(shè)備確認(rèn)2、輔助材料確認(rèn)3、人員確認(rèn)4、商品培養(yǎng)基及火菌培養(yǎng)基確認(rèn)5、菌種及菌液的制備四、樣品制備1、稀釋液2、供試液制備3、操作方法五、方法驗證1、需氧菌總數(shù)的計數(shù)方法驗證2、計算菌回收率公式六、驗證結(jié)果及評價七、再驗證周期八、驗證結(jié)論批準(zhǔn)一、引言1、概述：根據(jù)中國藥典2015年版三部 通則 “1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”（以下簡稱藥典）的要求，對內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中有微生物限度”檢查項的產(chǎn)品進行該項驗證。根據(jù)中國藥典2015年版三部 純化水 進行方法學(xué)確認(rèn)。2、驗證目的

2、：確保藥品微生物限度檢查實驗的準(zhǔn)確性，在建立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該樣品的需氧菌總數(shù)的測定。二、驗證方法合格標(biāo)準(zhǔn)1 .前提條件：培養(yǎng)基適用性實驗應(yīng)符合規(guī)定，即：被檢 R2A培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)與對照培 養(yǎng)基上菌落平均數(shù)比值應(yīng)為0.52 ,且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。2 .計數(shù)方法適用性試驗：在 3次獨立的平行試驗中，若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌 落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值與菌液對照組的平均菌落數(shù)的比值）均在0.52范圍內(nèi)，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的需氧菌總數(shù)。三、主要材料確認(rèn)1、儀器、設(shè)備確認(rèn)

3、名稱型號存點廠家工作 狀態(tài)校驗期至生化培養(yǎng)箱（3035c）HPS-400118室南京實驗儀器廠立式壓力蒸汽 火菌器LDZX-100KBS116室上海申安醫(yī)療 器械廠生物安全柜BSC-100n B2陽性室北京東聯(lián)哈爾儀器 制造有限公司冰箱HY-S13-03116室北京低溫設(shè)備廠熱空氣消毒箱GX625E116室天津廿泰斯特儀器 有限公司檢查結(jié)果:檢查人:復(fù)核人:日期:2、輔助材料確認(rèn)2.1 移液器、接種環(huán)、酒精燈、記號筆、酒精棉球、試管架、試管、玻璃平皿、止血鉗等2.2 需滅菌物品見微生物限度檢查法驗證記錄2.3 一次性無菌用具見下表無菌備品的檢查備品名稱批號功效期包裝情況薄膜過濾器無熱原吸頭尢菌

4、橡膠醫(yī)用手套檢查結(jié)果:檢查人：復(fù)核人：日期：3、人員確認(rèn)化驗員 經(jīng)設(shè)備操作、微生物檢驗技術(shù)和實驗室生物安全等方面的培訓(xùn)，考核合格后上崗。4、商品培養(yǎng)基及火國培養(yǎng)基4.1 所用培養(yǎng)基均不得有結(jié)塊、吸潮、異味、顏色發(fā)生改變等現(xiàn)象。培養(yǎng)基檢查結(jié)果，如下品名批號儲藏條件功效期生產(chǎn)1家胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基陰涼 干燥處三年R2A瓊脂培喬基陰涼 干燥處三年檢查結(jié)果:檢查人：復(fù)核人：日期：4.2 已滅菌培養(yǎng)基的檢查結(jié)果及結(jié)論見微生物限度檢查法驗證記錄5、菌種及菌液的制備5.1 菌種來源：黑龍江省藥檢所、公司收集的制藥用水系統(tǒng)中的菌落。菌種確認(rèn)菌種名稱傳代日期代數(shù)2 口 呂勺傳代人形態(tài)確認(rèn)銅綠假單胞菌年 月曰

5、枯草芽抱桿菌年 月曰水系統(tǒng)環(huán)境菌（凍 干三）取用一周內(nèi)該車間水系統(tǒng)環(huán)境菌水系統(tǒng)環(huán)境菌（凍 干二）取用一周內(nèi)該車間水系統(tǒng)環(huán)境菌水系統(tǒng)環(huán)境菌（固 體車間）取用一周內(nèi)該車間水系統(tǒng)環(huán)境菌5.2 菌液的制備分取銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、水系統(tǒng)環(huán)境菌（凍干三）、水系統(tǒng)環(huán)境菌（凍干二）、水系統(tǒng)環(huán)境菌（固體車間）的新鮮培養(yǎng)物少許接種至胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基上（環(huán)境菌應(yīng)預(yù)先用胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基平板增菌），3035c培養(yǎng)1824小時；上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白月東緩沖?制成每 1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。菌懸液制備后在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在 28c可在24h內(nèi)使用。5.

6、2.1 陰性對照：菌液制備時應(yīng)進行 2個平板或試管的陰性對照試驗，以確認(rèn)菌種制備有效。5.3 菌液菌落數(shù)：詳見微生物限度檢查法驗證記錄四、樣品制備1稀釋液：氯化鈉-蛋白月東緩沖液。2供試液制備：薄膜過濾法取本品1ml加氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100ml,混勻。3操作方法：取上述供試液100ml,按薄膜過濾法過濾，濾完后取出濾膜，菌面朝上貼于已裝載冷卻凝固的 R2A瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行制備兩個平皿。需氧菌總數(shù)計數(shù)平板倒 置于3035c培養(yǎng)箱培養(yǎng) 5天。五、方法驗證1 .培養(yǎng)基適用性試驗及有效期考察1.1 R2A瓊脂培養(yǎng)基制備基礎(chǔ)方法：取18.124g,加水1000ml,微溫溶解后，裝入4個25

7、0ml三角瓶。使用量較大時，按照驗證的裝載方式及滅菌程序，在其限定內(nèi)調(diào)整單次滅菌量?？赡艿难b載方式：80L滅菌鍋250m1*10并T3層或者500m1*7瓶*3層100L滅菌鍋 250m1*22瓶*2層或者500m1*15瓶*2層滅菌條件為：121 C、0.1MPa, 15min。含第7日、14日、21日的有效期考察，每次適用性試驗需要使用600ml;共需3次。1.1.1 對照培養(yǎng)基的制備：取對照培養(yǎng)基一袋，加水 300ml,微溫溶解，裝入相同容積三角瓶中，與被檢培養(yǎng)基相同條件同時滅菌。1.2 接種上述5種菌株至待測 R2A瓊脂培養(yǎng)基平板（每個平板中含培養(yǎng)基1520ml）,每個菌株平行制備2個

8、平板；同樣方法接種上述菌株至對照培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度3035 C,時間不超過 3天。被檢培養(yǎng)基上每種菌株的平均菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基上的平均菌落數(shù)比值應(yīng)在0.52,且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基一致。1.3 在第7日、14日和21日按1.2方法使用1.1配制的R2A瓊脂培養(yǎng)基，及新制備的對照 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基適用性檢查。穩(wěn)定性及有效期考察表次數(shù)比值（0.52）及性致性銅綠枯草凍干一菌落凍干一菌落固體菌落湊L次第二次第三次結(jié)論：評價人：評價日期:2需氧菌總數(shù)的計數(shù)方法驗證2.1 設(shè)置試驗組、菌液對照組、供試品對照組，分別取三個不同日期的供試品（選擇儲罐取樣點）進彳T 3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每

9、次試驗的回收率。試驗菌液為銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌。（1）試驗組 取上述供試液100ml,分別加入含菌數(shù)不大于 100cfu/ml的試驗菌液1ml,按薄膜過濾法過濾。過濾完畢后取出濾膜，菌面朝上貼于已裝載冷卻凝固的R2A瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行制備兩個平皿。（2）菌液對照組取上述供試液100ml,加入氯化鈉-蛋白月東緩沖液1ml,按薄膜過濾法過濾。過濾完畢后取出濾膜，菌面朝上貼于已裝載冷卻凝固的R2A瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行制備兩個平皿。（3）供試品對照組取氯化鈉-蛋白月東緩沖液100ml,分別加入含菌數(shù)不大于100cfu/ml的試驗菌液1ml,按薄膜過濾法過濾。過濾完畢后取出濾膜，菌面朝上貼于

10、已裝載冷卻凝固的R2A瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行制備兩個平皿。2.2 上述實驗三個純化水車間（凍干粉針二車間、凍干粉針三車間、口服固體制劑車間）同步進行，可使用同一組陰性對照；培養(yǎng)溫度3035C,時間不超過3天。各組實驗檢查結(jié)果及結(jié)論見檢驗記錄。2.2.1 需要主要材料：、已滅菌R2A瓊脂培養(yǎng)基720ml、薄膜過濾器36套。2.3 計算菌回收率公式：試驗組菌的回收率=試驗組平均菌落數(shù)供試品對照組平均菌落數(shù)菌液對照組的平均菌落數(shù)計數(shù)方法適用性表次數(shù)回收率比值（凍干二）銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌A次第二次第三次次數(shù)回收率比值（凍干三）銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌A次第二次第三次次數(shù)回收率比值（固體）銅綠假單

11、胞菌枯草芽抱桿菌A次第二次第三次結(jié)論:評價人：評價日期：3.供試品檢查3.1 每個車間三批樣品（同一個點、不同日期，減少隨機誤差，便于統(tǒng)計分析），按上述驗證的方法檢驗，即取水樣 1ml,加氯化鈉-蛋白月東緩沖液稀釋至 100ml,取該100ml溶液進 行薄膜過濾，取濾片，菌面向上，貼于 R2A瓊脂培養(yǎng)基平板；平行制備兩個平板，同法 以氯化鈉-蛋白月東緩沖液代替樣品進行陰性對照試驗；將上述平板于3035 c培養(yǎng)不少于5天；陰性對照不得有菌生長（同時檢驗的各批產(chǎn)品可使用一個陰性對照平板）且三批 檢驗均應(yīng)能獲得準(zhǔn)確結(jié)果。3.2 每日主要材料：已滅菌R2A瓊脂培養(yǎng)基200ml,薄膜過濾器10套。3.3

12、檢驗結(jié)果次數(shù)日期車間凍干二凍干三固體A次月 日第二次月 日第三次月 日結(jié)論:評價人:評價日期: 六、驗證結(jié)果及評價：方案實施人員是否經(jīng)過相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)或路演口 ；實施前儀器設(shè)備操作及人員能力確認(rèn)是否有效口 ；實施前相關(guān)校準(zhǔn)、檢定及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、關(guān)鍵耗材準(zhǔn)備是否充分口；實施項目是否完整、正確口；實施過程是否未曾發(fā)生偏差、變更或其它異?？?；需要說明的情況： 評價人：評價日期：七、再驗證周期：需要進行本次再確認(rèn)的情況主要有：純化水生產(chǎn)工藝變更、檢驗培養(yǎng)基供應(yīng)商變更、檢驗用薄膜過濾器的形式變更；檢驗人員的不穩(wěn)定因素；若有其他可能影響計數(shù)準(zhǔn)確性的 變更應(yīng)考慮實施本確認(rèn)。否則，本確認(rèn)再驗證周期為5年。八、驗證結(jié)

13、論批準(zhǔn)：驗證小組:日期附件一：微生物限度檢查法驗證記錄微生物限度檢查法驗證記錄品名：純化水取樣口:來源:1.實驗室環(huán)境舞作室名稱微生物限度室陽性對照室壓差（Pa）溫度（C）濕度（%）沉降菌（cfu）檢查結(jié)果：檢查人：日期:2.滅菌物品確認(rèn)火菌物品滅菌方式溫度時間日期尢菌服、口罩濕熱平皿、量筒干熱檢查結(jié)果：檢查人：日期：3 .滅菌后培養(yǎng)基的確認(rèn)3.1 滅菌后培養(yǎng)基瓶和塞子不得有破裂，避免形成氣泡，培養(yǎng)基應(yīng)呈均勻溶液狀態(tài)，不得有 析出沉淀，PH值不能超過規(guī)定值的i0.2,不得污染微生物。促生長能力符合規(guī)定。已配制滅菌培養(yǎng)基在有效期內(nèi)，如下表所示:品名火菌 方式火菌后pH貯藏條件配制 日期批號配制人

14、胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基濕熱R2A瓊脂培喬基濕熱檢查結(jié)果：檢查人：日期:4 .菌液懸液計數(shù)結(jié)果稀釋級菌落計數(shù)檢查結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋級/代數(shù)計數(shù)結(jié)果（cfu）銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌水系統(tǒng)環(huán)境菌（凍干二）水系統(tǒng)環(huán)境菌（凍干二）水系統(tǒng)環(huán)境菌（固體）結(jié)論：制備人：復(fù)核人：日期:5 .需氧菌總數(shù)的計數(shù)方法驗證菌落計數(shù)結(jié)果組別銅綠假單胞菌（cfu）枯草芽抱桿菌（cfu）菌落數(shù)平均數(shù)菌落數(shù)平均數(shù)試驗組菌液對照組供試品對照組10試驗組菌回收率%檢驗結(jié)果:日期:附件二：純化水微生物限度檢驗記錄純化水微生物限度檢驗記錄品 名樣品來源車間濕 度溫 度C檢驗依據(jù)驗證力不報告日期年月日方法：取本品（1） ml,加氯化鈉-蛋白月東緩沖液至（100） ml,制備兩份，分別混勻以薄膜濾器過濾，分別取下濾膜，菌面向上貼在R2A瓊脂平板上（避免產(chǎn)生氣泡），同法制備陰性對照平板2個；傳出上述平板，置 3035c培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每日觀察，觀察 5天，計數(shù)、計 算結(jié)果。主要儀器、設(shè)備、耗材：熱空氣消毒箱型號：GX625E編號：HY-104立式壓力蒸氣滅菌器型號：LDZH-100KBs編號：HY-001集菌儀型號：HTY-2000B編號：HY-089R2A培養(yǎng)基批號：生化培養(yǎng)箱型號：HPS-400儀器編號：HY-培養(yǎng)觀察培養(yǎng)溫度： C （3035C）,培養(yǎng)時間： 天（