控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程

1、控制菌（大腸埃希菌）檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編制人編制日期年 月 日編制部門審核人審核日期年 月 日審核部門批準人批準日期年 月 日頒發(fā)部門編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件1 .目的建立一個控制菌大腸埃希菌控制菌大腸埃希菌檢查標準工作程序，規(guī)范QC控制菌大腸埃希菌檢查人員的控制菌大腸埃希菌檢查的操作。2 .范圍適用于本公司的口服制劑完成內(nèi)包后外包前的中間體和局部給藥制劑產(chǎn)品的內(nèi)包裝材料的控制菌大腸埃希菌的檢測。3 .責任者QC控制菌大腸埃希菌檢查人員；質量管理部4 .內(nèi)容4.1 檢測準備4.1.1 QC人員接到控制菌大腸埃希菌檢查的 工作進程計劃單

2、后，核對取樣指令， 確定控制菌大腸埃希菌檢查所需容器具、試液、培養(yǎng)基等項目和數(shù)量，執(zhí)行 微生物檢查 準備工作操作程序和培養(yǎng)基配制操作規(guī)程，進行控制菌大腸埃希菌檢查前的準備工作。4.1.2 為了保證被檢品在取樣后規(guī)定的時間內(nèi)完成檢驗，取樣前應準備好檢驗需要的各 種器皿（清洗一干燥一包裹）、培養(yǎng)基和稀釋劑等（配制一分裝一包裹），并滅菌備用。4.2 供試液的制備4.2.1 供試液 供試液是指按照供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法將供 試品制成供試驗用的均勻液體。4.2.2 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物需特性，采取適宜的方法制備供試 液。如果使用了乳化劑、分散劑、中和劑和滅活劑，其

3、用量應證明是有效的，并對微生 物的生長和存活無影響性。4.2.2.1 可溶性液體供試品第1頁/共7頁文件名稱控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,混勻，作為供試液?？?溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。4.2.2.2 非水溶性液體供試品油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯 80使供試品分散均勻，然后再加 0.9%無菌氯化鈉- 蛋白陳緩沖液至100m,混勻，作為供試液。4.2.2.3 水溶性固體、半固體或黏稠性供試品稱取供試品10g,置PH7.0

4、無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml中，用勻漿儀或其他適宜 方法，混勻，作為1: 10供試液。必要時可加適量的無菌聚山梨酯 80,并置水浴中適當 加溫使供試品分散均勻。4.2.2.4 非水溶性供試品取供試品5g（5m1）,加入含溶化的（溫度不超過45C） 5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、 10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45CpH7.0無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,邊加邊攪拌，使其充分乳化，作為 1:20供試液。 4.2.2.5腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10 g,加PH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或 PH7.6無菌磷酸鹽緩沖 液（用于

5、結腸溶制劑）至100ml,置45c水浴中，振搖，使溶解，作為1:10的供試液。 4.2.2.7具抑菌成分供試品當供試品抑菌活性時，應消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查，一般使用培養(yǎng)基稀釋 法，取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不 含抑菌作用。取低稀釋級供試液（原液或 1:10的供試液）2份，每份各1ml,分別注入 5個或5個以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml）,每個平皿傾注培養(yǎng)基約 15ml,混勻， 凝固后，倒置培養(yǎng)，按每1ml分注的平皿點計菌落數(shù)之和計數(shù)，即為每 1ml的菌落數(shù)， 共得2組數(shù)據(jù)，再以2組數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。4.2.2.8

6、供試液的制備若需用水浴加溫時，溫度不應超過45C,時間為30min。第2頁/共7頁文件名稱控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3檢驗操作4.3.1操作程序MUG蛋白陳36 C 1824hr供試品EMB或麥康凱瓊脂平36l C1824hr疑似菌落純培養(yǎng)36 土 C 1824hrMUG陽 性Indole陽MUG陰 性MUG陽 性MUG陰 性Indole陰Indole陰Indole 陽革蘭氏染色、鏡檢36 巾 61824hJ報告報告4.3.2 培養(yǎng)基選擇與標記4.3.2.1 增菌培養(yǎng)使用膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基，標記

7、符號為BL4.3.2.2 快速生化試驗使用4-甲基傘形酮葡萄甘酸蛋白陳培養(yǎng)基，標記符號為MUG4.3.2.3 分離培養(yǎng)使用曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC4.3.2.4 純培養(yǎng)使用營養(yǎng)瓊脂（YYO培養(yǎng)基，標記符號為 YY第3頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.2.5 乳糖發(fā)酵試驗使用乳糖（RD培養(yǎng)基、5暗L糖培養(yǎng)基，標記符號為 RT4.3.2.6 靛基質試驗（I ）使用蛋白陳水培養(yǎng)基，標記符號為 RT標記符號為I4.3.2.7 甲基紅試驗（M）使用磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基，

8、標記符號為M4.3.2.8 乙酰甲基甲醇生產(chǎn)試驗（V-P）使用磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基，標記符號為V-P4.3.2.9 枸檬酸鹽利用試驗（C）使用枸檬酸鹽培養(yǎng)基，標記符號為 C4.3.3 陽性對照與陰性對照4.3.3.1 陽性對照試驗 對各供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗，加菌量為 10100cfu ,培養(yǎng)、檢查等方法按照供試品的各控制菌檢查同法進行，陽性對照試驗應 檢出相應的控制菌；已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時可不必再做陽性對照。4.3.3.2 陰性對照試驗 取稀釋劑10ml加入100ml （或200ml）相應控制菌檢查用的相 應培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應無菌生長。4.3.4 增菌培

9、養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基2份，每份各100ml。一份加入10ml供試液（相當于供試品 1g或1ml）,另一份加入與供試液等量的稀釋劑作為陰性對照。 溫度36C,培養(yǎng)824hr, 必要時可延至48hr。陰性對照應無菌生長。4.3.5 快速生化試驗4.3.5.1 取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMUGW養(yǎng)基的試管內(nèi)，溫度 36c培養(yǎng)，于 5hr和24hr時在366nm紫外燈光下觀察，同時用未接種的MUGg養(yǎng)基作為本底對照。在 紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈藍白色熒光，則為 MUG日性；不呈現(xiàn)熒光，則為 MU制性。4.3.5.2 觀察后，沿著培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質試液，若液面呈玫瑰紅色，則為靛

10、基質陽性；若呈試劑本色，則為靛基質陰性。本底對照的MUG口靛基質試驗應為陰性。4.3.5.3 如果MUG日性、靛基質陽性，則判供試品檢出大腸埃希菌；如果MUCK性、靛基質陰性，則判供試品未檢出大腸埃希菌。4.3.6 分離培養(yǎng)第4頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.6.1 如果呈現(xiàn)MUG日性、靛基質陰性或者 MUCK性、靛基質陽性時，則應將上述供 試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)蘸取 12環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB MacC平板上， 溫度36c培養(yǎng)1824hr。4.3.6.2 觀察平板，若EMBm

11、MacC平板上無菌落生長或生長的菌落與大腸埃希菌菌落 形態(tài)特征不符，則判供試品未檢出大腸埃希菌。4.3.6.3 觀察平板，當陽性對照的平板呈典型菌落生長時，若 EMB| MacC平板上生長 的菌落與大腸埃希菌菌落形態(tài)特征相符或疑似時，應挑取可疑菌落23個以上菌落分別 進行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗，確認大腸埃希菌。4.3.6.4 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征菌落形態(tài)EMB呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心， 圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常后金屬光澤MacC鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形、扁平，邊緣整齊，表面光滑， 濕潤4.3.7 純培

12、養(yǎng)4.3.7.1 如果EM嗽MacC板上生長的菌落與大腸埃希菌菌落形態(tài)特征相符或疑似時， 以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，蘸取培養(yǎng)物，應挑選23個以上疑似菌落,分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，溫度 36c培養(yǎng)1824hr,進行以下檢查。4.3.7.2 如果平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（如呈紫黑色或有金屬光澤），則 應蘸取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EMB MacC平板,溫度36c培養(yǎng)1824hr,再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，進行以下檢查。4.3.8 革蘭氏染色、鏡檢4.3.8.1 以接種環(huán)蘸取無菌水于潔凈無劃痕的載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜 面新鮮培養(yǎng)物少許

13、，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰23次固定。第5頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.8.2 在載玻片的菌斑上滴加結晶紫染液，染色 1min,水洗。4.3.8.3 滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。4.3.8.4 滴加95叱醇，嚴格控制時間脫色 2030s,水洗。4.3.8.5 滴加沙黃染液，復染1min,待干后，鏡檢。4.3.8.6 鏡檢結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色；大腸埃希菌為革蘭 氏陰性短桿菌或球桿菌。4.3.9 生化（IMViC）試驗4.3.9.1

14、乳糖發(fā)酵試驗取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，溫度36 c培養(yǎng)2448hr,觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色，指示劑為澳麝香草酚藍者為黃色）， 產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大?。榱吮苊膺t緩發(fā)酵產(chǎn)生假陰性，也可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細菌，可于 24hr出現(xiàn)陽性，或適當延長培養(yǎng)時 問。4.3.9.2 靛基質試驗（I ）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白陳水培養(yǎng)基中，溫度 36c培 養(yǎng)2448hr,沿管壁加入靛基質試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈 試劑本色為陰性。98%勺大腸埃希菌靛基質t僉為陽性，一般 24Hr即可出現(xiàn)陽性結果， 以無菌操作先從管中取出1ml

15、或2ml培養(yǎng)液進行檢查，如靛基質陰性，余下的蛋白陳水 培養(yǎng)物再培養(yǎng)24hr,做靛基質試驗。4.3.9.3 甲基紅試驗（M 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基中，溫 度36c培養(yǎng)48及hr,于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液 23滴（約每1ml培養(yǎng)液1滴）， 輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。4.3.9.4 乙酰甲基甲醇生產(chǎn)試驗（V-P）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基中，溫度36c培養(yǎng)48支hr,于2ml培養(yǎng)液中加入a-蔡酚乙醇試液1ml,混勻， 再加40%6氧化鉀試液0.4ml,充分振搖，在4hr （通常在30min時）內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽 性，無紅色判

16、為陰性。第6頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.9.5 枸檬酸鹽利用試驗（C）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上， 溫度36c培養(yǎng)24天,培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時，判為陽性， 培養(yǎng)基顏色無變化、無菌苔生長，判為陰性。4.4結果判定4.4.1 當陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗 MU（陽性、靛基質陽性，供試品 MUG日 性、靛基質陽性，報告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；供試品 MU制性、靛基質陰 性，報告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。4.4.2 當陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗 MUG1陽性、靛基質陽性，供試品 MUG日 性、靛基質陰性、IMViC試驗為“-+ -”、革蘭氏陰性桿菌，報