p53p27及mdm2在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)

1、p53、p27及mdm2在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá) 作者：李紅偉 紀(jì)祥瑞 趙潔 丁力 王建偉【摘要】 目的 研究p53、p27和mdm2蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中的表達(dá)及其與GIST生物學(xué)行為的關(guān)系，為預(yù)測該腫瘤的侵襲潛能提供理論依據(jù)和可能的預(yù)測指標(biāo)。方法 收集68例手術(shù)切除的GIST標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中p53、p27和mdm2蛋白的表達(dá)，并結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及生物學(xué)行為評價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 68例GIST中p53、p27和mdm2蛋白陽性表達(dá)率分別為75%、54.41%和27.94%。p53陽性表達(dá)率在極低度侵襲危險(xiǎn)性（VLR）、低度侵襲危險(xiǎn)性（LR）和高度侵襲危險(xiǎn)性（H

2、R）組三組間，細(xì)胞核分裂數(shù)10/50 HPF和10/50 HPF 兩組間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），在腫瘤直徑5 cm和5 cm兩組間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）； p27陽性表達(dá)率在VLR、LR和HR組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），在腫瘤直徑5 cm和5 cm兩組間差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；mdm2陽性表達(dá)率在細(xì)胞核分裂數(shù)10/50HPF和10/50HPF 兩組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論 p53、p27和mdm2蛋白表達(dá)與GIST的發(fā)生、發(fā)展有關(guān), 檢測p53、p27及mdm2表達(dá)可以作為GIST生物學(xué)行為評價(jià)的有效指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】 胃腸道間質(zhì)瘤

3、；p53；p27；mdm2；免疫組織化學(xué) 【Abstract】 Objective To investigate the expression of p53，p27 and mdm2 protein in gastrointestinal stromal tumor (GIST) , and discuss the relationship between their expression and clincopathological characteristics.Methods Immunohistochemical staining was used to detect the expr

4、ession of p53，p27 and mdm2 in 68 cases of GIST.Their relations with histomorphology and biological behavior were analyzed statistically.Results In 68 cases GIST, the positivity of p53，p27 and mdm2 protein were 75%，54.41% and 27.94% respectively.The expression of p53 protein was inversely correlated

5、with the fletcher degree , morphologic variant (P0.05) and tumor diameter(P0.01) of GIST. The expression of p27 protein was inversely correlated with the fletcher degree (P0.05) and tumor diameter of GIST (P0.01) . The expression of mdm2 protein was inversely correlated with the morphologic variant

6、(P0.01) of GIST.Conclusion These data shows the expression of p53，p27 and mdm2 are related to the ontogenesis and progression of GIST. p53，p27 and mdm2 may be prognostic indicators in GIST. 【Key words】 gastrointestinal stromal tumor，p53，p27，mdm2，immunohistochemistry p53是目前研究最為廣泛深入的抑癌基因之一, 而mdm2為近幾年發(fā)

7、現(xiàn)的一種(小鼠)雙微體癌基因，二者表達(dá)的相關(guān)性日益受到關(guān)注。p27屬CDKI基因（細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑），是CDK的負(fù)性調(diào)控因子，也是一種抑癌基因。CDKI其蛋白的低表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是一種并非少見、特征為CKIT突變陽性的間葉源性腫瘤，它主要發(fā)生在胃腸道，但也可發(fā)生在其他腹腔盆腔部位，其臨床生物學(xué)行為表現(xiàn)復(fù)雜，部分呈明顯良性過程，部分呈肯定的惡性表現(xiàn)。 有關(guān)p53、p27及mdm2在GIST中的表達(dá)，目前國內(nèi)少見報(bào)道。因此，檢測GIST中p53、p27及mdm2的蛋白表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，了解p53、p27及mdm2在GIST發(fā)生、發(fā)

8、展中的有指導(dǎo)作用。 1 材料與方法 1.1 材料來源 收集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科20052008 年手術(shù)切除的GIST腫瘤組織蠟塊共68例，臨床和病理資料完整；其中男32 例(47.06%)，女36 例(52.94%)，中位年齡59.8 歲（33103 歲）；病變部位分布：胃34例(50%)，腸20例(29.41%)，其他14例(20.59%)。腫瘤直徑大于5 cm 34例（50%），小于5 cm者34例（50%）；按組織學(xué)分型：梭形細(xì)胞型50例（73.52%），上皮樣細(xì)胞型9例（13.24%），混合細(xì)胞型9例（13.24%）；按腫瘤核分裂像數(shù)10/50 HPF 55例（80.88%），

9、核分裂像數(shù)10/50 HPF 13例（19.12%）。按Fletcher分級標(biāo)準(zhǔn)1，7例(10.29%)為極低度侵襲危險(xiǎn)性（VLR）、20例(29.41%)為低度侵襲危險(xiǎn)性（LR）、14例(20.59%)為中度侵襲危險(xiǎn)性(IR) 、27例(39.71%)為高度侵襲危險(xiǎn)性（HR）。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10中性福爾馬林固定、石蠟包埋、制成4 m厚連續(xù)切片4張；常規(guī)蘇木素伊紅染色1張；p53、p27及mdm2免疫組織化學(xué)染色3張。選取15例取自胃腸道腫瘤大體標(biāo)本腫瘤遠(yuǎn)端組織作為正常對照組。 1.2 免疫組化試劑來源及染色方法 鼠抗人p53單克隆抗體工作液、鼠抗人p27蛋白單克隆抗體工作液、鼠抗人mdm2

10、單克隆抗體原液0.1 ml、PV二步法檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用PV法進(jìn)行免疫組化染色,用已知陽性片和磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗分別作為陽性和陰性對照。p53、p27及mdm2免疫組化實(shí)驗(yàn)均需熱修復(fù)，mdm2免疫組化實(shí)驗(yàn)一抗?jié)舛?100。 1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) p53和p27蛋白在GIST的表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，mdm2蛋白的表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿。出現(xiàn)棕黃色顆粒或彌漫的棕黃色為陽性細(xì)胞。記分參照Remmele and Stegnerde的IRS(Immunoreactive score)法2，即3個(gè)參數(shù)半定量計(jì)數(shù)方法：根據(jù)染色強(qiáng)

11、度、陽性細(xì)胞數(shù)和兩者計(jì)分的乘積進(jìn)行判斷，分為陰性“”、弱陽性“”、中強(qiáng)陽性“”、強(qiáng)陽性“”。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)：陽性細(xì)胞數(shù)5%為0分；陽性細(xì)胞數(shù)6%25%為1分；陽性細(xì)胞數(shù)26%50%為2分；陽性細(xì)胞數(shù)51%75%為3分；陽性細(xì)胞數(shù)75%為4分。陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩積分相乘，0分為陰性（），14分為弱陽性（），58分為中度陽性（），912分為強(qiáng)陽性（）。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 免疫組化結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用卡方檢驗(yàn)，校正卡方檢驗(yàn)及精確檢驗(yàn)法分析p53、p27及mdm2蛋白表達(dá)與GIST臨床病理指

12、標(biāo)的關(guān)系。P0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 p53、p27及mdm2蛋白表達(dá) 68例GIST中p53陽性者51例（75%），p27陽性者37例（54.41%），mdm2蛋白表達(dá)陽性者19例（27.94%）。在對照組中，p27蛋白表達(dá)陽性率為93.33%（14/15），p53 和mdm2均呈陰性表達(dá)。p53 和mdm2在GIST中的表達(dá)陽性率顯著高于對照組（P0.01；P0.05），p27在GIST中的表達(dá)陽性率顯著低于正常對照組（P0.01）。免疫組化結(jié)果見圖13。 2.2 p53、p27及mdm2蛋白表達(dá)與臨床、病理特征的關(guān)系。 2.2.1 p53與 GIST臨床病理特征的

13、關(guān)系：68例中，p53陽性表達(dá)率在GIST的Fletcher分級中，其VLR、LR組分別與HR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）,三組陽性率分別為14.29%、70%和92.59%；在腫瘤直徑5 cm和5 cm兩組的陽性率分別為58.82%和91.18%，差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）（表1）；細(xì)胞核分裂數(shù)10/50 HPF和10/50 HPF 兩組的陽性率分別是69.09%和100%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）（表1）。p53的表達(dá)在男女兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)；與腫瘤的組織學(xué)分型，部位和有無壞死的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2.2.2 p27與 GIST臨床病

14、理特征的關(guān)系：68例中，p27陽性表達(dá)率隨腫瘤侵襲危險(xiǎn)程度的增加而有降低的趨勢，其VLR和LR組分別與HR組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），三組陽性率分別為85.71%、70%和33.33%；在腫瘤直徑5 cm和5 cm兩組的陽性率分別為70.59%和38.24%，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）（表1）。p27的表達(dá)在男女兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)；與腫瘤的組織學(xué)分型、核分裂像數(shù)目、部位和有無壞死的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。表1 p53、p27及mdm2表達(dá)與腫瘤直徑和核分裂像的關(guān)系p53陽性陰性Pp27陽性陰性Pmdm2陽性陰性 2.2.3 mdm2與

15、GIST臨床病理特征的關(guān)系：68例中，mdm2陽性表達(dá)率在細(xì)胞核分裂數(shù)10/50HPF和10/50HPF 兩組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），兩組的陽性率分別為21.82%和53.85%（表1）。mdm2的表達(dá)在男女兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)；mdm2的表達(dá)在GIST的Fletcher分級，腫瘤的組織學(xué)分型、部位和有無壞死的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3 討論 p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因,50%以上的人類腫瘤都檢測到p53基因的突變。野生型p53基因?yàn)槟[瘤抑制因子，突變型p53則具有癌基因活性。野生型p53蛋白分子的半衰期短，不易檢測。由異常

16、（突變型）p53基因編碼的突變型p53蛋白有較長的半衰期，容易通過免疫組化檢測到。本研究結(jié)果顯示，p53蛋白在GIST中的表達(dá)明顯高于在正常對照組中的表達(dá)（P0.01），表明p53基因突變及其產(chǎn)物的積累與GIST的發(fā)生關(guān)系密切。p53蛋白表達(dá)在極低度侵襲危險(xiǎn)性（VLR）GIST和低度侵襲危險(xiǎn)性（LR）GIST的表達(dá)均低于高度侵襲危險(xiǎn)性（HR）GIST的表達(dá)，其陽性表達(dá)率隨腫瘤侵襲危險(xiǎn)程度的增加而有升高的趨勢，這與Gumurdulu等3的研究結(jié)果相同，此結(jié)果表明，伴隨GIST Fletcher分級升高，p53表達(dá)也升高，突變型p53基因失去原有的生長抑制功能，獲得增殖、轉(zhuǎn)化和致瘤潛能，其高表達(dá)可

17、以促進(jìn)GIST細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化，提示p53基因突變在腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展中起一定作用，有可能成為臨床判定GIST風(fēng)險(xiǎn)程度分級的重要參考指標(biāo)。同時(shí)，p53在不同核分裂像數(shù)和不同大小的GIST中表達(dá)有差別，核分裂像數(shù)和腫瘤直徑是公認(rèn)的判斷GIST良惡性的指標(biāo)，因此，我們認(rèn)為p53可以作為判斷其良惡性的可靠指標(biāo)。 p27屬CDKI基因（細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑），是CDK的負(fù)性調(diào)控因子，也是一種抑癌基因。CDKI其蛋白的低表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。p27蛋白表達(dá)缺失或降低可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，p27蛋白在GIST的陽性率較正常組織低（P0.01），說明GIST中明顯存在p27 蛋白

18、表達(dá)缺失或降低，證實(shí)p27 在細(xì)胞正常分化中起重要作用，p27蛋白表達(dá)水平的降低與GIST的發(fā)生有關(guān), 且隨著GIST Fletcher分級升高, p27表達(dá)降低4，證明p27是具有抑癌作用的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子, 在GIST進(jìn)展過程中, 隨著表達(dá)的逐漸下調(diào), 功能逐步喪失, 腫瘤細(xì)胞更具侵襲力, 惡性程度更高。應(yīng)用免疫組化技術(shù)測定GIST中p27蛋白的表達(dá)情況，可作為GIST生物學(xué)行為的指標(biāo)，對判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后具有重要的參考意義。另外，本研究結(jié)果還顯示p27在不同大小的GIST中表達(dá)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）,更進(jìn)一步說明p27作為GIST良惡性判斷指標(biāo)的可靠性。p27是p53

19、基因下游調(diào)控因子, 其表達(dá)受野生型p53的誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)研究表明, p53蛋白表達(dá)隨著腫瘤風(fēng)險(xiǎn)分級升高而升高,而p27陽性表達(dá)率隨著腫瘤風(fēng)險(xiǎn)分級升高而降低, 推測兩者在GIST的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在一定的協(xié)同關(guān)系，也有可能兩者表達(dá)無相關(guān)性，而在GIST的發(fā)生發(fā)展過程中分別獨(dú)立的起作用。 mdm2為近幾年發(fā)現(xiàn)的一種(小鼠)雙微體癌基因。mdm2是p53蛋白的負(fù)調(diào)控因子，一方面p53 基因激活了mdm2基因的表達(dá)；另一個(gè)方面mdm2促進(jìn)p53 磷酸化形式的降解，抑制p53 基因轉(zhuǎn)錄活性。已有研究結(jié)果表明, mdm2與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)5。本研究mdm2蛋白在GIST中的表達(dá)明顯高于正常對照

20、組（P0.05），表明mdm2參與了GIST的形成過程，推測mdm2表達(dá)過強(qiáng)可封閉p53介導(dǎo)的反式激活作用,使p53功能喪失,導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定及細(xì)胞增生,從而表現(xiàn)出癌基因蛋白的作用,參與腫瘤形成。另外，mdm2陽性表達(dá)與GIST核分裂像計(jì)數(shù)有關(guān)（P0.01），核分裂像數(shù)是公認(rèn)的判斷GIST良惡性的指標(biāo)之一，有關(guān)GIST預(yù)后指標(biāo)的幾項(xiàng)研究中，核分裂像計(jì)數(shù)被著重強(qiáng)調(diào)。因此，考慮mdm2可作為判斷GIST良惡性的指標(biāo)之一。mdm2和p53之間的關(guān)系是目前研究熱點(diǎn)之一。一般認(rèn)為，mdm2水平升高時(shí)會導(dǎo)致抑癌蛋白p53功能的喪失，mdm2過表達(dá)只發(fā)生在野生型p53陽性病例中，而在突變型p53病例中很少有

21、mdm2的表達(dá)。我們的研究結(jié)果顯示，在GIST中既有mdm2的過表達(dá)又有p53的突變，說明在GIST中p53的突變和mdm2的過表達(dá)可以同時(shí)發(fā)生，其它腫瘤中有與此相似的研究結(jié)果6，7。本研究68例GIST中p53與mdm2均陽性者14例，提示兩者在GIST的發(fā)生發(fā)展中有一定的協(xié)同作用。推測腫瘤細(xì)胞內(nèi)突變型p53的大量積聚能促進(jìn)mdm2基因的表達(dá)，而mdm2并不能使穩(wěn)定性增強(qiáng)的突變型p53降解，最終可以引起腫瘤組織內(nèi)mdm2和p53蛋白均出現(xiàn)過度表達(dá)。p53與mdm2均陽性的14例GIST中有10例為高度侵襲危險(xiǎn)性（HR），提示p53與mdm2的協(xié)同表達(dá)陽性者對GIST生物學(xué)行為的判斷意義更高。

22、 GIST臨床生物學(xué)行為表現(xiàn)復(fù)雜，難以判斷其良惡性及預(yù)后。p53、p27及mdm2都是與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的重要因子，且三者表達(dá)均與GIST細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)，p53與mdm2共同陽性表達(dá)對GIST生物學(xué)行為有重要的判斷意義。因此，檢測p53、p27及mdm2表達(dá)可以作為GIST生物學(xué)行為評價(jià)的有效指標(biāo)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Fletcher CD,Berman JJ,Corless C,et al.Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors:a consensus approachJ.Hum Pathol,2002,33(5):459465.2 Kohlberger PD, Breitenecker F,Kaider A,et al.Modified truecolor computerassisted image analysis versus subjectiv