PPARγ在胃癌的表達(dá)及曲格列酮對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

1、PPAR在胃癌的表達(dá)及曲格列酮對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 作者：崔濤，劉瑩，朱祖安，劉霞【摘要】 目的 探討過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）在胃癌及癌前病變中的表達(dá)，研究PPAR激動(dòng)劑曲格列酮（troglitazone,TGZ）對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901生長(zhǎng)抑制作用及其作用機(jī)制。方法 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PPAR在胃癌及癌前病變中的表達(dá)；體外培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞給予TGZ干預(yù)，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)、蘇木精-伊紅染色、免疫細(xì)胞化學(xué)方法、Western blot檢測(cè)TGZ作用后SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)情況、凋亡率及細(xì)胞周期的改變、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、PPAR表達(dá)情況。結(jié)

2、果 免疫組化染色結(jié)果顯示在輕度不典型增生、重度不典型增生及胃癌標(biāo)本中PPAR陽(yáng)性表達(dá)率為15.15（5/33）、66.67（14/21）、71.43（60/84），輕度不典型增生與重度不典型增生及胃癌組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SGC7901細(xì)胞與不同濃度的TGZ共同培養(yǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，TGZ 50 mol/L組與對(duì)照組相比P0.05，同時(shí)其作用具有濃度及劑量依賴性，蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)較陰性對(duì)照組逐漸稀疏，出現(xiàn)細(xì)胞體積變小、形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞皺縮、核固縮、胞漿空泡等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。免疫組織化學(xué)染色顯示PPAR在SGC7901細(xì)胞中有較高表

3、達(dá)，50 mol/L與陰性對(duì)照組及低濃度25mol/L組相比P0.05，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示TGZ 25 mol/L組起作用72 h后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，處于G0/G1與S期的細(xì)胞比例與陰性對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。Western blot結(jié)果顯示 TGZ作用72 h后與陰性對(duì)照組相比，高濃度50 mol/L組PPAR表達(dá)增加（P0.01）。結(jié)論 應(yīng)用TGZ可以將SGC7901細(xì)胞阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制其增殖。 【關(guān)鍵詞】 過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體; SGC7901胃癌細(xì)胞; 曲格列酮 過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferators-a

4、ctivated receptor, PPAR）屬于核受體超家族成員，是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子；人類PPAR有3種亞型，分別為PPAR、PPAR/、PPAR1。研究發(fā)現(xiàn)PPAR在脂肪肉瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤組織和細(xì)胞系中有較高水平的表達(dá)，但是研究同時(shí)顯示PPAR激動(dòng)劑能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞株分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡2-4。目前，對(duì)于PPAR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用尚不明確。本研究在通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PPAR在胃癌中的表達(dá)的同時(shí)，體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細(xì)胞給予PPAR激動(dòng)劑干預(yù)后檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖的改變，以探討PPAR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 1 材料

5、和方法 1.1 PPAR在胃癌及癌前病變中的表達(dá) 1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 所有標(biāo)本取自徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院20012004年胃鏡活檢及手術(shù)切除標(biāo)本。84例胃癌中男性 61例,女性 23例,年齡3177歲,平均 57.5歲,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 56例。不典型增生標(biāo)本中,輕度不典型增生 33例,重度不典型增生 21例。所有胃癌患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)化療和放療。 1.1.2 試驗(yàn)方法 采用免疫組化PowerVision兩步法進(jìn)行染色 (按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,抗原修復(fù)均采用高壓熱修復(fù) )。用 PBS取代一抗作為空白對(duì)照 ,已知陽(yáng)性組織片作為陽(yáng)性對(duì)照。PPAR購(gòu)自北京中杉試劑公司（美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，sc-

6、6285）。PPAR主要定位于細(xì)胞核，染色后光鏡觀察免疫組化染色切片的顯色反應(yīng)，高倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)>10% , 判定為陽(yáng)性。 1.2 體外實(shí)驗(yàn) 體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細(xì)胞（購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），給予PPAR激動(dòng)劑曲格列酮（troglitazone，TGZ，美國(guó)Cayman公司）干預(yù)后檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的改變。 1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 以DMSO液體配成濃度100 mmol/L，-20保存?zhèn)溆?。TGZ作用濃度分為6組：0、6.25、12.5、25、50、100 mol/L共6個(gè)劑量組。四唑藍(lán)比色試驗(yàn)按照上述分組進(jìn)行，根據(jù)MTT結(jié)果挑選出

7、第1、4、5組進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。 1.2.2 四唑藍(lán)比色試驗(yàn)（MTT法） 取SGC7901細(xì)胞1×108/L接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 l，置37、5%CO2及飽和濕度條件下待24 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄上清，按照上述實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)分別加入含有TGZ的培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)2板，分別培養(yǎng)至48 h、72 h，棄上清，每孔加入5 g/L MTT液20 l，4 h后每孔加入150 l DMSO振蕩混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度，計(jì)算抑制率。抑制率=（1給藥組D值/空白組D值）&#

8、215;100%。 1.2.3 蘇木精-伊紅染色 用1640培養(yǎng)液稀釋腫瘤單細(xì)胞懸液濃度至2×105/ml，以每孔1 ml單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，培養(yǎng)板每孔內(nèi)放置3枚直徑10 mm的圓形蓋玻片。按照實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，每組每孔分別加入含有TGZ的培養(yǎng)液各1 ml。當(dāng)SGC7901細(xì)胞與TGZ共同培養(yǎng)72 h后，取出6孔板內(nèi)的玻片，4%多聚甲醛固定510 min，取出晾干，干燥徹底后即可進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察形態(tài)學(xué)改變。 1.2.4 免疫組織化學(xué)染色及Western blot 檢測(cè)TGZ作用72h后SGC7901細(xì)胞PPAR表達(dá) 1.2.4.1 免疫組織化學(xué)染色步驟 用1640培養(yǎng)液稀

9、釋腫瘤單細(xì)胞懸液濃度至2×108/L，以每孔1 ml單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，培養(yǎng)板每孔內(nèi)放置3枚直徑10 mm的圓形蓋玻片。按照上述實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，每組每孔分別加入含有TGZ的培養(yǎng)液各1 ml。當(dāng)SGC7901細(xì)胞與TGZ共同培養(yǎng)72 h后，取出6孔板內(nèi)的玻片，4%多聚甲醛固定510 min，取出晾干，干燥徹底后即可進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法)。PPAR一抗稀釋濃度1300，PPAR表達(dá)的判定以細(xì)胞核中有明顯棕黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞；光鏡高倍鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（即陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比）。 1.2.4.2 Western blo

10、t檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞消化，吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×108/L，置于100 ml培養(yǎng)瓶中，每瓶10 ml，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄上清，按照上述實(shí)驗(yàn)分組，加藥作用72 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE ），轉(zhuǎn)膜后加入含羊抗人PPAR多克隆抗體（1500稀釋）的一抗封閉液，置搖床上30 min，4過(guò)夜，次日漂洗封閉后加入堿磷酶標(biāo)記兔抗羊IgG（12000稀釋）的封閉液，置搖床上晃動(dòng)2 h后漂洗，NBT/BCIP顯色液顯色，觀察蛋白表達(dá)的改變。 1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期 用RPMI 1

11、640培養(yǎng)液稀釋腫瘤單細(xì)胞懸液濃度至2×108/L，以每孔1 ml單細(xì)胞懸液接種于24孔板中于37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，每組每孔分別加入含有TGZ的培養(yǎng)液各1 ml，培養(yǎng)48 h、72 h后，收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定，PI染液染色后采用Beckon/Dickinson FACS Calibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，在488 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)493 nm處的紅色熒光。檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期改變。 1.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Stata8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析，并采用S

12、cheffe法分析組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：=0.05。 2 結(jié) 果 2.1 PPAR在胃癌中表達(dá) 在輕度不典型增生、重度不典型增生及胃癌標(biāo)本中，PPAR陽(yáng)性表達(dá)率為15.15（5/33）、66.67（14/21）、71.43（60/84），輕度不典型增生與重度不典型增生及胃癌組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05） ，重度不典型增生與胃癌組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.2.1 MTT法檢測(cè)應(yīng)用TGZ對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響 SGC7901細(xì)胞與不同濃度的TGZ共同培養(yǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，當(dāng)藥物作用48 h，TGZ濃度達(dá)50 mol/L及以上時(shí)，與對(duì)照組相比P0.05

13、，同時(shí)其作用具有濃度及劑量依賴性（表1）。 表1 TGZ作用48、72 h后對(duì)SGC7901細(xì)胞抑制作用與0 mol/L組比較:P<0. 05 2.2.2 形態(tài)學(xué)觀察TGZ對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的影響 SGC7901細(xì)胞與TGZ共同培養(yǎng)72 h，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)較陰性對(duì)照組逐漸稀疏，細(xì)胞體積變小、形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞皺縮、核固縮、胞漿空泡等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（圖 1）。圖1 TGZ作用SGC7901 后形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（蘇木精-伊紅染色，10×40） 2.2.3 TGZ作用后胃癌SGC7901細(xì)胞PPAR的改變 2.2.3.1 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TGZ作用后胃癌SGC7901細(xì)胞

14、PPAR的改變 PPAR在SGC7901細(xì)胞中有較高表達(dá)，低濃度25 mol/L組TGZ作用后與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；高濃度50 mol/L組與陰性對(duì)照組及低濃度25 mol/L組相比有顯著性差異（P<0.05）（表2、圖2）。 表2 TGZ作用72 h后PPAR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率 2.2.3.2 Western blot 檢測(cè)TGZ作用72 h后SGC7901細(xì)胞PPAR的表達(dá)水平 TGZ作用72 h后與陰性對(duì)照組相比，高濃度50 mol/L組PPAR表達(dá)增加（P<0.01），低濃度25 mol/L組PPAR表達(dá)未見(jiàn)明顯改變（P&a

15、mp;gt;0.05）（圖3）。 2.2.4 細(xì)胞凋亡 25 mol/L TGZ可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡，應(yīng)用藥物后細(xì)胞凋亡率明顯升高，48 h后50 mol/L與0 mol/L組、25 mol/L組比較P<0.05（表3）。表3 TGZ 對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡率的影響與0 mol/L組、25 mol/L組比較：P<0.05 2.2.5 細(xì)胞周期的改變 高濃度用藥組處于G0/G1與S期的細(xì)胞比例與陰性對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組腫瘤細(xì)胞處于G2/M期的細(xì)胞比例之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表4）。表4

16、TGZ對(duì)SGC7901細(xì)胞周期的影響與0 mol/L組比較：P<0. 05 3 討 論 PPAR是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，它是由英國(guó)科學(xué)家Issemann和Green于1990年首先克隆成功，屬于型核受體超家族成員1。目前發(fā)現(xiàn)PPAR家族在脊椎動(dòng)物中至少有3種亞型:PPAR、PPAR、PPAR。PPAR最初被認(rèn)為是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的核激素受體，近年來(lái)其在抗腫瘤方面的研究較多，PPAR與相應(yīng)的配體結(jié)合后，轉(zhuǎn)入核內(nèi)結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（peroxisome proliferator responsive element,PPRE），調(diào)節(jié)c-ras、c-myc、

17、c-fos等生長(zhǎng)調(diào)控基因的表達(dá)；同時(shí)還調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子、黏附分子以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等的表達(dá)，對(duì)PPAR研究已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。 本研究結(jié)果顯示PPAR在胃癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于輕度不典型增生組織，提示PPAR表達(dá)與胃癌的發(fā)生存在一定的關(guān)系，這與眾多學(xué)者研究結(jié)果是一致的。但近來(lái)研究結(jié)果卻顯示PPAR激動(dòng)劑對(duì)胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、腎癌等惡性腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)凋亡和促進(jìn)分化作用3,5-10。因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)用PPAR激動(dòng)劑TGZ處理胃癌SGC7901細(xì)胞后觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGZ作用后SGC7901細(xì)胞PPAR蛋白表達(dá)明顯升高，同時(shí)不同濃度TGZ對(duì)于

18、SGC7901細(xì)胞發(fā)揮不同程度生長(zhǎng)抑制作用，抑制作用具有濃度及時(shí)間依賴性，高濃度藥物（50 mol/L）與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異。至于其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，結(jié)果提示TGZ可誘導(dǎo)SGC7901G0/G1的細(xì)胞比例增加、細(xì)胞凋亡增加。 研究顯示PPAR/RXR能被 PPAR、RXR激動(dòng)劑單獨(dú)或協(xié)同激活形成PPAR/RXR二聚體，再結(jié)合于PPRE激活目的基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮調(diào)控作用11。其作用的機(jī)制主要有：通過(guò)泛素-蛋白體蛋白降解途徑，上調(diào)周期素依賴激酶抑制因子p21Waf1、p27Kip1的表達(dá)12-13；通過(guò)抑制炎癥及核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子（如TNF、IL-4、NF-B）的活性而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)

19、14-15；降低凋亡抑制蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)，從而激活caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑16；抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤血管生成17。那么如何去理解PPAR在胃癌中高表達(dá)，而其激動(dòng)劑卻可以抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)在胃癌中可能存在PPAR過(guò)表達(dá)與RXR表達(dá)失平衡而無(wú)法形成有效的PPAR/RXR二聚體進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此進(jìn)一步探討RXR在胃癌中的表達(dá)及其聯(lián)合使用二者激動(dòng)劑對(duì)胃癌細(xì)胞的影響將是本研究繼續(xù)研究的方向與內(nèi)容?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Lemberger T, Desvergne B, Wahli W. Peroxisome prolifera

20、tor-activated receptors: a nuclear receptor signaling pathway in lipid physiology J.Annu Rev Cell Dev Biol,1996,12:335-363.2 Leung WK, Bai AH, Chan VY, et al. Effect of peroxisome proliferator activated receptor gamma ligands on growth and gene expression profiles of gastric cancer cells J. Gut, 200

21、4, 53 (3) : 331-338.3 Shimada T, Kojima K, Yoshiura K, et al. Characteristics of the peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARgamma) ligand induced apoptosis in colon cancer cells J. Gut, 2002, 50 (5) : 658-664.4 Krishnan A, Nair SA, Pillai MR. Biology of PPAR gamma in cancer: a critical

22、 review on existing lacunae J. Curr Mol Med,2007,7(6):532-540.5 Kawa S, Nikaido T, Unno H,et al. Growth inhibition and differentiation of pancreatic cancer cell lines by PPAR gamma ligand troglitazone J .Pancreas,2002,24(1):1-7.6 Burstein HJ, Demetri GD, Mueller E, et al. Use of the peroxisome proli

23、ferator-activated receptor (PPAR) gamma ligand troglitazone as treatment for refractory breast cancer: a phase II study J . Breast Cancer Res Treat，2003,79(3):391-397.7 Butler R, Mitchell SH, Tindall DJ, et al. Nonapoptotic cell death associated with S-phase arrest of prostate cancer cells via the p

24、eroxisome proliferator-activated receptor gamma ligand, 15-deoxy-delta12,14-prostaglandin J2 J. Cell Growth Differ,2000,11(1):49-61.8 Li MY, Deng H, Zhao JM,et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands inhibit cell growth and induce apoptosis in human liver cancer BEL-7402 cells J

25、. World J Gastroenterol,2003,9(8):1683-1688.9 Chang TH, Szabo E. Induction of differentiation and apoptosis by ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in non-small cell lung cancer J. Cancer Res,2000,60(4):1129-1138.10 Inoue K, Kawahito Y, Tsubouchi Y,et al. Expression of peroxis

26、ome proliferator-activated receptor gamma in renal cell carcinoma and growth inhibition by its agonists J. Biochem Biophys Res Commun,2001,287(3):727-732.11 Kliewer SA, Umesono K, Noonan DJ,et al. Convergence of 9-cis retinoic acid and peroxisome proliferator signaling pathways through heterodimer f

27、ormation of their receptorsJ. Nature,1992,358(6389):771-774.12 Han S, Sidell N, Fisher PB,et al. Up-regulation of p21 gene expression by peroxisome proliferator-activated receptor gamma in human lung carcinoma cells J. Clin Cancer Res,2004,10(6):1911-1919.13 Aiello A, Pandini G, Frasca F,et al. Peroxisomal proliferator-activated receptor-gamma agonists induce partial reversion of epithelial-mesenchymal transition in anaplas