慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)血管活性物質(zhì)表達(dá)的變化及意義

1、慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)血管活性物質(zhì)表達(dá)的變化及意義 作者：彭利靜，李志超，李偉，李志斌，閆志強(qiáng)，張齊，劉毅，羅穎 【關(guān)鍵詞】 慢性 Expressions of ANP and CGRP in plasma of rats with chronic hypoxic pulmonary hypertension and their clinical significance 【Abstract】 AIM: To observe the expression of such vasoactive peptides as atrial natriuretic peptide (ANP) and

2、 calcitonin generelated peptide (CGRP) in the plasma of rats with chronic hypoxic pulmonary hypertension (HPH). METHODS: Twelve chronic HPH rat models were established in lowpressure and hypoxic conditions and divided evenly into 2 groups: hypoxic 2week group and hypoxic 3week group. Another 6 rats

3、as control group were fed under normal pressure and normoxia conditions. The expressions of ANP and CGRP in the plasma of HPH rats were detected by radioimmunoassay (RIA) method. RESULTS: RIA results showed that compared with the concentrations of ANP and CGRP in plasma of control group, the concent

4、rations of ANP and CGRP in plasma of hypoxic 2week group decreased while those of hypoxic 3week group increased. The tendency was hypoxic 3week groupcontrol grouphypoxic 2week group. Compared with those in hypoxic 2week group, the expressions of ANP and CGRP were higher in hypoxic 3week group (P&

5、;lt;0.05). CONCLUSION: In the process of chronic HPH, the expressions of ANP and CGRP in plasma decrease first and then increase. ANP and CGRP may play a regulative role in pulmonary hypertension and pulmonary arterial reconstruction in chronic HPH rats. There is a correlation between the lowpressur

6、e and hypoxia induced HPH and the increased ANP and CGRP in rats. 【Keywords】 hypoxic; pulmonary artery; smooth muscle; ANP; CGRP; rats 【摘要】 目的: 觀察慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)大鼠血漿中心房鈉尿肽(ANP)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的表達(dá)變化. 方法: 用低壓、低氧的方法復(fù)制大鼠慢性HPH模型，放射免疫法檢測血漿中血管活性物質(zhì)ANP和CGRP表達(dá)的變化. 結(jié)果: 慢性HPH大鼠血漿中血管活性物質(zhì)ANP和CGRP的表達(dá)均發(fā)生了變化，呈現(xiàn)先降低后增高

7、的表現(xiàn)， 即低氧3 wk正常低氧2 wk. 結(jié)論: 在慢性HPH形成過程中，隨著肺小動(dòng)脈壁的增厚，血漿中血管活性物質(zhì)ANP和CGRP的表達(dá)先降低后增高. 其變化可能與慢性HPH過程中肺動(dòng)脈壓升高和肺小動(dòng)脈壁的結(jié)構(gòu)重建有一定關(guān)系. 【關(guān)鍵詞】 低氧；肺動(dòng)脈；平滑??；心房鈉尿肽；降鈣素基因相關(guān)肽；大鼠 0引言 低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)疾病，常繼發(fā)于久居高原或胸、肺和心臟疾病. 其中，肺小血管收縮和肺小血管結(jié)構(gòu)重建是其發(fā)病的基本病理過程. 急性HPH多以肺小血管收縮為主，而慢性HPH的形成是以肺小血管重建為主1-

8、2. 血管活性物質(zhì)心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）均是體內(nèi)的舒血管因子和細(xì)胞增長的負(fù)調(diào)控因子. 我們采用放射免疫法測定ANP和CGRP在慢性HPH發(fā)生過程中的變化，以探討慢性HPH不同階段ANP和CGRP的水平變化及其之間的相互關(guān)系. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠18只（由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量180260 g. ANP放免藥盒和CGRP放免藥盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫所）；烏拉坦（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）. 1.2

9、方法 1.2.1動(dòng)物分組及制模將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、低氧2 wk組和低氧3 wk組，每組6只. 在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)2 d后給予低氧、低壓處理. 正常對(duì)照組于常壓常氧下飼養(yǎng)，低氧組采用間斷性低壓低氧處理，即將動(dòng)物放進(jìn)低壓低氧艙后，3 min左右將艙內(nèi)壓力升至相當(dāng)于海拔高度2000米，再使壓力緩慢上升至相當(dāng)于海拔5000米高度，使氧濃度保持在100 mL/L左右，每日持續(xù)8 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別持續(xù)2 wk（低氧2 wk組）和3 wk（低氧3 wk組）. 1.2.2取材和組織準(zhǔn)備動(dòng)物在最后一次低氧完成后次日用200 g/L烏拉坦腹腔麻醉(4 mL/kg)，打開腹腔，從下腔靜脈取靜脈血

10、2 mL，注入含100 g/L的EDTA二鈉30 L和抑肽酶40 L的試管中，混勻，4，3000 r/min離心10 min，分離血漿，置-20保存. 測定前使樣本置于室溫或冷水中復(fù)融，再次4，3000 r/min離心5 min，取上清測定. 取出心臟，用紗布沾去血跡，剪去心房組織，沿室間隔邊緣剪下右心室，分別稱量右心室和左室加室間隔的質(zhì)量，以右室質(zhì)量（左室質(zhì)量室間隔質(zhì)量）R/(L+S)和右室質(zhì)量/體質(zhì)量(R/BW)來反映右心室質(zhì)量的變化，確定有無右室肥厚. 1.2.3病理檢查及血漿ANP，CGRP濃度測量打開動(dòng)物胸腔，取左肺下部的部分組織，在生理鹽水中快速漂洗去血液后，放入Bousin液中固

11、定，其上用一小塊紗布?jí)鹤∫员ＷC肺組織全部浸泡在固定液中，24 h后移入700 mL/L乙醇中，梯度脫水、抽氣、透明，石蠟包埋后，做成石蠟切片. 常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察. 按說明書用放射免疫法測量血漿ANP，CGRP濃度.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 各組間比較采用方差分析. 2結(jié)果 2.1右心質(zhì)量變化低氧2 wk后大鼠右心質(zhì)量即有明顯增加，R/(L+S)和R/BW均較正常對(duì)照組增多（P<0.01）. 低氧3 wk后增加更為顯著，但低氧2 wk組和缺氧3 wk組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）. 表1低氧不同時(shí)

12、間大鼠右心質(zhì)量變化(略) 2.2病理檢查HE染色可見正常大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺小動(dòng)脈內(nèi)膜完整平滑，肌層無肥厚. 低氧2 wk后可見肺小動(dòng)脈壁厚度增加，動(dòng)脈壁中層肥厚，管腔出現(xiàn)部分狹窄. 低氧3 wk后肺小動(dòng)脈壁增厚更為顯著，出現(xiàn)明顯肥厚的肌層，管腔亦明顯狹窄(圖1). 圖1各組肺組織HE染色結(jié)果HE ×250 2.3血漿ANP，CGRP濃度低氧2 wk后大鼠血漿ANP和CGRP的濃度較正常對(duì)照組減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 低氧3 wk后兩者濃度均顯著升高，與低氧2 wk組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 總體呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(表2). 3討論 HPH常引起嚴(yán)重的呼吸

13、血流功能紊亂且治療困難，因而一直是臨床研究的重點(diǎn). 本研究結(jié)果表明低氧2 wk后大鼠右心室質(zhì)量即有明顯改變，同時(shí)肺組織病理切片顯示，低氧2 wk后肺小動(dòng)脈管壁增厚，管腔部分狹窄. 低氧3 wk后變化更為顯著，可見明顯增厚的動(dòng)脈壁中層，說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功. 在慢性HPH的形成過程中，心臟發(fā)生器質(zhì)性病變，肺小動(dòng)脈壁發(fā)生了細(xì)胞增殖，結(jié)構(gòu)重建，肺動(dòng)脈高壓已經(jīng)形成. 同時(shí)驗(yàn)證慢性低壓低氧不僅造成肺血管系統(tǒng)功能的改變，還導(dǎo)致肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的重建. 表2低氧后大鼠血漿ANP，CGRP變化(n=6, ng/L, x±s)組別ANPCGRP正常對(duì)照492±12379±40低氧2

14、wk384±8345±17低氧3 wk625±67a167±77aaP<0.05 vs低氧2 wk組. ANP: 心房鈉尿肽；CGRP：降鈣素基因相關(guān)肽. ANP主要在心房合成、儲(chǔ)存和分泌，具有較強(qiáng)的利鈉利尿、擴(kuò)血管降壓、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和對(duì)抗腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAAS）、內(nèi)皮素（Endothelin，ET）和交感系統(tǒng)等作用. 朱妙章等3、呂順艷等4報(bào)道ANP可以抑制多種來源細(xì)胞的增殖，尤其可以抑制低氧引起的心肌細(xì)胞過度增殖. 王培勇等5實(shí)驗(yàn)表明，低氧24 h血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌ANP減少. CGRP是體內(nèi)最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)之一，

15、可以顯著對(duì)抗ET的作用，起到降低血壓、減少血管阻力、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)心肌的作用. 李曉艷等6研究結(jié)果表明，CGRP可以減少人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的3HTdR摻入量及DNA合成，說明CGRP可以抑制人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程. Chattergoon等7報(bào)道CGRP可以有效抑制PASMC增殖，并推測細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子p53在其中可能有一定的作用.在HPH時(shí)，ANP和CGRP在血漿中的變化已引起部分學(xué)者的關(guān)注，結(jié)果不盡相同，但大多數(shù)結(jié)果表明，在肺動(dòng)脈高壓后期血漿中ANP和CGRP都是升高的7-8. 然而對(duì)于二者的動(dòng)態(tài)觀察卻鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)觀察到在慢性HPH的發(fā)生發(fā)展中，ANP和CG

16、RP在血漿中的含量呈現(xiàn)先降低后增高的現(xiàn)象，其本質(zhì)是機(jī)體的一種適應(yīng)代償性機(jī)制. 在低氧刺激后，機(jī)體表現(xiàn)為低氧和氧分壓減少，為適應(yīng)這一變化，機(jī)體發(fā)生多種代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為呼吸加深加快，從而使肺泡通氣量增加. 而在循環(huán)系統(tǒng)則表現(xiàn)為心輸出量增加、血流減少，靜脈血摻雜，提高動(dòng)脈血氧分壓9. 肺血管的收縮和肺動(dòng)脈壁的增厚與體內(nèi)舒血管物質(zhì)如ANP，CGRP的減少有一定的關(guān)系，推測此時(shí)舒血管物質(zhì)的減少與其過度消耗有關(guān). 至低氧3 wk時(shí)，由于低氧時(shí)間的增長，肺動(dòng)脈已經(jīng)發(fā)生了顯著肥厚性變化，此時(shí)肺動(dòng)脈壓的顯著增加，右心室的明顯肥厚均可以刺激機(jī)體合成和分泌ANP和CGRP增多，導(dǎo)致二者在血漿中的濃度出現(xiàn)顯著增

17、高，其生理意義在于調(diào)節(jié)過高的肺動(dòng)脈壓力和抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過度增殖. ANP和CGRP含量的變化與其合成分泌和消耗有關(guān)，低氧時(shí)血漿中ANP和CGRP含量變化的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步探討. 【參考文獻(xiàn)】1 Mehran M，YuanCheng B，F(xiàn)ung WH，et al. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular remodeling：role in the development of pulmonary hypertensionJ. Microvasc Res， 2004, (68)：75-103.2 Marc H，N

18、icholas WM，Stephen LA，et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertensionJ. J Am Coll Cardiol, 2004,43(12)：13S-24S.3 朱妙章，呂順艷，于軍. 血管鈉肽抑制心肌增殖與機(jī)制的研究J. 心臟雜志，2002,14（5）：374-376.4 呂順艷，朱妙章，郭海濤，等. 血管鈉肽抑制低氧誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,23(10)：884-8865 王培勇，劉健，許蜀閩，等. 缺氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌血管活性肽的影響J.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1998,23（1）：32-34.6 李曉艷, 黃從新，孫有剛，等. 降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用J. 中國病理生理雜志, 2000,16（1）：24-26.7 Chattergoon NN，DSouza FM，Den