盤狀結(jié)構域受體2胞外區(qū)在酵母系統(tǒng)中的融合表達純化和功能鑒定

1、盤狀結(jié)構域受體2胞外區(qū)在酵母系統(tǒng)中的融合表達、純化和功能鑒定 作者：陳健康張偉劉楠楠劉利兵田菲鐵茹 【摘要】 目的： 盤狀結(jié)構域受體2（discoidin domain receptor2, DDR2）是一種與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移相關的蛋白酪氨酸激酶，研究DDR2在類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）軟骨破壞和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用. 方法： 在畢赤酵母中表達DDR2胞外區(qū)片段（不含信號肽和跨膜區(qū)，命名為DR），并將所表達的蛋白進行純化和功能鑒定，以備將來用作DDR2的特異性阻斷劑. 結(jié)果： 獲得了兩株較高表達HisDR融合蛋白的畢赤酵母克??；其表達的蛋白質(zhì)中可溶性部分約占全部

2、融合蛋白的18%；經(jīng)NiNTA(nitrictriacetic acid)柱純化后，獲得了純度約90%以上的可溶性HisDR融合蛋白；競爭結(jié)合抑制實驗顯示，HisDR具有阻斷和細胞表面天然DDR2受體結(jié)合的功能. 結(jié)論： 所表達的融合蛋白HisDR具有抑制天然DDR2功能的作用. 【關鍵詞】 盤狀結(jié)構域受體2：胞外區(qū)；基因表達；阻斷劑 【Abstract】 AIM: To investigate the role of discoidin domain receptor 2 (DDR2) in the destruction of cartilage in rheumatoid arthrit

3、is (RA) and tumor metastasis. METHODS: We expressed extracellular domain of DDR2 fused with a His tag to increase protein solubility and facilitate purification (without signal peptide and transmembrane domain, designated DR) in Pichia pastoris, purified the expressed protein, and characterized its

4、function, for the purpose of future application as a specific DDR2 antagonist. RESULTS: Two clones with relatively high expression of HisDR were obtained. After purification by a NiNTA (nitrictriacetic acid) chromatographic column, soluble fused HisDR with over 90% purity was obtained. Competitive b

5、inding inhibition assay demonstrated that the expressed HisDR could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors on synovial cell surface. CONCLUSION: Extracellular domain of DDR2 fused with a His tag could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors. 【Keywords】 discoidin domain rec

6、eptor 2; extracellular domain; gene expression; blocker 0引言 盤狀結(jié)構域受體(discoidin domain receptors，DDR2)是一類帶有盤狀結(jié)構域的受體型酪氨酸激酶，這類激酶在哺乳類動物體內(nèi)有兩種，分別為DDRl和DDR21. 研究發(fā)現(xiàn)，這類激酶廣泛分布，與某些腫瘤的轉(zhuǎn)移相關，其中DDRl表達于腫瘤的組織細胞而DDR2表達于間質(zhì)細胞2-6. 人關節(jié)滑膜組織也表達DDR27. 對于DDR2，纖維性膠原，如I, 和型膠原，是它的配體，膠原與DDR2的結(jié)合可上調(diào)細胞MMP1的表達8. 為了研究DR2在腫瘤轉(zhuǎn)移和類風濕性關節(jié)炎中

7、的作用，DDR2特異性阻斷劑將是一個有力的工具. 但由于DDR2是一種比較新的分子，目前對它的研究又不多，所以尚無特異性的受體阻斷劑. 可溶性受體作為特異性受體阻斷劑已被廣泛應用于多種受體的功能研究甚至作為抑制劑進入臨床治療. 其機理是在細胞外，外源的模擬受體分子由于與天然受體結(jié)構相同而競爭性地與相應配體結(jié)合，從而阻斷了配體與天然受體的結(jié)合，也就抑制了配體和受體相應的功能. 我們采用此策略對DDR2胞外區(qū)用畢赤酵母系統(tǒng)進行了表達. 為了增加蛋白質(zhì)的可溶性，選擇了融合表達方式：采用pPIC3.5K載體，表達His融合蛋白. 融合蛋白經(jīng)純化后，通過競爭抑制實驗驗證其是否阻斷配體II型膠原與細胞表面

8、DDR2的結(jié)合，通過細胞實驗驗證其是否抑制II型膠原刺激下的細胞MMPl的分泌. 1材料和方法 1.1材料 重組質(zhì)粒pRsetAddrg2由本室構建；pPIC3.5K酵母表達載體、酵母GS115菌種、氨基酸混合物、大腸桿菌E.coli Top 10 F購自 invitrogen公司；酵母氮堿（YNB）、酵母消解酶、酸洗玻璃珠、Tween20為Sigema公司產(chǎn)品；山梨醇、膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒為上海華舜生物技術公司產(chǎn)品；鼠抗6His mAb, NTA親合介質(zhì)購于Qiagen公司；HRP標記的羊抗鼠二抗購自Santa Cruz Biotechnology公司；Western發(fā)光底物為Pierce

9、公司產(chǎn)品，NC膜購于Amersham公司. 1.2方法 1.2.1PCR引物設計pPIC3.5K的多克隆位點只有EcoRI和NotI適合ddrg2插入，考慮到Kozak序列（ACC ATG G）有利于外源基因在酵母中的表達，在6 His翻譯起始碼ATG上游引入ACC，又將ATG后的C堿基突變?yōu)镚. 兩條引物分別為：5端為：5 CGGAATTCACCATGGGGGGTTCTCATCATCATCAT 3和3端為：5 CGGGCGGCCGCTTAAGTGTTGCTGTCATCAACTTTAAGCATTGG 3. 1.2.2PCR產(chǎn)物回收、克隆及序列鑒定將PCR產(chǎn)物回收后直接與pMDl8T載體連接，轉(zhuǎn)

10、化大腸桿菌后挑克隆酶切鑒定，將鑒定正確的克隆送基康公司測序. 1.2.3DR片段在pPIC3.5K載體中的亞克隆大量提取重組T載體質(zhì)粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，連入用同樣方法處理的pPIC3.5K載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定. 1.2.4重組載體的酵母電轉(zhuǎn)化取10 L（約5 g）Sal單酶切線性化的pPIC3.5Kddr2重組質(zhì)粒與80 L酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞混勻，轉(zhuǎn)移于預冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯，冰浴5 min. 電轉(zhuǎn)化后（參數(shù)為1500 V, 25 F, 200 ）立即加入500 L預冷的1 mol/L山梨醇，混勻，鋪于RDB板，30培養(yǎng)34 d. 以上過程同

11、時做空載體對照. 1.2.5多拷貝整合重組酵母的篩選用2 mL的1 mol/L山梨醇收集所有酵母重組菌落后混勻，分別取100200 L鋪于含G418分別為0, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 5 mg/mL的YPD板上，30培養(yǎng)34 d. 1.2.6重組酵母菌落的PCR鑒定挑含G418濃度較高的YPD板上的單菌落于0.5 mL離心管中，加10 L去離子水、5 L 5 U/L的酵母消解酶混勻，30溫育10 min，再-70凍10 min. 冰融后作為PCR模板，PCR引物為pPIC3.5K載體多克隆位點兩側(cè)的引物：5端為：5GACTGGTTCCAATTG

12、ACAAGC 3；3端為：5GCAAATGGCATTCTGACATCC3. PCR反應參數(shù)為：94 30 s；56 1 min；72 90 s，30個循環(huán). 1.2.7DDR2DR 蛋白的酵母誘導表達及鑒定挑多拷貝重組酵母單菌落于30 mL的MGY培養(yǎng)液中，30, 250 r/min培養(yǎng)18 h. 室溫2500 r/min離心5 min，菌體重懸于300 mL的MM培養(yǎng)基中. 30培養(yǎng)3 d（期間每隔24 h加甲醇至5 g/L）后離心收菌，菌體沉淀用10 mL裂解液重懸后，加入等體積的酸洗玻璃珠劇烈振蕩30 s；冰浴30 s，重復8次. 4高速離心10 min，上清為裂菌液. 取15 L裂菌液

13、進行SDSPAGE和Western Blot鑒定表達. 1.2.8DDR2DR蛋白的親合純化用10 mL洗滌液平衡NTANi2+柱，將裂菌液上樣. 用5 mL Lysis緩沖液洗柱，再用15 mL Washing緩沖液洗柱，用3 mL Elution緩沖液洗脫DDRG2蛋白，收集洗脫液，0.5 mL/管. 1.2.9競爭結(jié)合抑制實驗包被RA細胞于96孔板上，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h：PBS洗滌5 min共3次. 加入倍比稀釋的HisDR溶液. 空白對照為His純化蛋白質(zhì)洗脫液（內(nèi)無蛋白質(zhì)），陰性對照為His純化蛋白質(zhì)(用pRSETA空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達和純化得到)，濃度為0.1

14、mg/L,各孔加入等量的II型膠原(不溶型，超聲打散)的PBS液，37溫育1 h：PBS洗滌5 min共3次：加入抗型膠原抗體，37溫育1 h： PBS洗滌5 min共3次. 加入HRP標記的羊抗鼠二抗，37溫育0.5 h. PBS洗滌5 min共3次. 加入ABTS顯色液顯色. 在ELISA儀上檢測A410的吸光度. 2結(jié)果 2.1DDR2胞外區(qū)片段DR的PCR擴增、克隆和序列分析10 g/L瓊脂糖電泳顯示，PCR產(chǎn)物為約1.3 kb的特異性片段，將此條帶回收，即與pMDl8T載體連接，酶切鑒定后，對其中一個陽性克隆進行測序，并將序列在GenBank中進行分析，結(jié)果顯示，序列完全正確. 圖1

15、顯示，PCR產(chǎn)物和重組pMDl8T載體酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果. 2.2重組酵母表達載體pPIC3.5KDR的構建及鑒定大量提取重組pMDl8T載體質(zhì)粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，連入用同樣方法處理的pPIC3.5K載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定. 圖2顯示，重組pPIC3.5KDR載體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果. 2.3重組酵母菌的篩選和PCR鑒定酵母電轉(zhuǎn)化后每個RBD板上約長出5×103個His陽性單菌落，G418濃度篩選最高為4.0 mg/mL，根據(jù)同源重組一個載體約抵抗0.25 mg/mL G418估算，同源重組入同一酵母菌的pPIC3.5K ddrg

16、2串聯(lián)拷貝數(shù)最高可達到15個以上. 圖3顯示，重組酵母菌的PCR鑒定結(jié)果. 2.4DR蛋白的表達和鑒定對PCR鑒定后的3號和4號重組菌進行目的蛋白質(zhì)的誘導表達，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，3, 4號陽性克隆細菌在約46 ku處均有一新生表達條帶（HisDR），與目的蛋白質(zhì)大小相符（圖4）. 根據(jù)薄層掃描結(jié)果分析，上清中的新生蛋白質(zhì)約占融合蛋白質(zhì)總量的18. WesternBlot驗證結(jié)果顯示：6 HisDDRG2胞外區(qū)蛋白DR在畢赤酵母中可以表達，且為可溶性表達（圖5). 2.5HisDR蛋白的純化利用NiNTA agarose柱通過金屬螯合親合層析進行純化，從酵母表達菌體的裂菌液上清中純化

17、出了天然可溶形式的6 His融合DR蛋白. 本實驗中，洗脫液中含有目的蛋白質(zhì)，薄層掃描分析顯示，目的蛋白質(zhì)純度達90.5（圖6）. 通過蛋白質(zhì)定量，計算可溶性目的產(chǎn)物的得量約為400 g/L細菌(結(jié)果未列出). 2.6HisDR對II型膠原與DDR2結(jié)合的競爭抑制功能我們摸索了在不同型膠原濃度(2.5 mg/L，0.25 mg/L，0.025 mg/L)下，梯度濃度(0.4mg/L，110；1100；1200；1400；1800；11 600；13200；16 400；112 800；125 600)的HisDR蛋白對膠原結(jié)合于細胞表面DDR2的影響. 這里II型膠原為不溶型的，反應時懸浮于P

18、BS中. 結(jié)果顯示(圖7)，對于膠原0.025 mg/L組，加入His純化的其他蛋白做對照的孔顯色最深，說明His純化的其他蛋白無封閉II型膠原與細胞表面DDR2結(jié)合的功能；對于HisDR孔，從0.4 mg/Ll800范圍內(nèi)，基本無顯色，說明HisDR可以完全封閉II型膠原與DDR2的結(jié)合；從11600開始有顯色，13 200125 600顯色逐漸加深，說明HisDR的存在可以競爭抑制II型膠原與細胞表面DDR2的結(jié)合. 表達的HisDR融合蛋白在體外可以與II型膠原結(jié)合，起到競爭抑制DDR2受體的作用. 3討論 DDRs是一類受體型蛋白酪氨酸激酶，由于其胞外區(qū)含有一個類似盤基網(wǎng)柄菌（disc

19、oidin）凝集素盤狀結(jié)構I的DR結(jié)構，而被稱為DDRs. DDR2廣泛表達于多種組織，這種廣泛又有選擇性的分布提示，DDR2的功能是重要且特異的1. 原位雜交顯示，在肺癌和卵巢癌中，DDR2在癌細胞周圍間質(zhì)細胞高表達，提示DDR2在腫瘤發(fā)展中具有作用，可能腫瘤細胞轉(zhuǎn)化后的侵襲和轉(zhuǎn)移特性由DDR2介導，因為惡性細胞突破組織屏障需要破壞胞外基質(zhì)8. 其他能降解基質(zhì)的人類疾病如肺纖維化、肝硬化、骨硬化病和類風濕關節(jié)炎可能都存在DDR2的表達和信號轉(zhuǎn)導過程，推測DDR2的一個重要功能可能是通過調(diào)節(jié)膠原的合成和降解來控制膠原性胞外基質(zhì)水平. 若能找到阻斷DDR2作用的分子，則可能有助于預防腫瘤細胞的轉(zhuǎn)

20、移和減輕類風濕性關節(jié)炎的軟骨破壞9. 由于目前尚不清楚DDR2胞外區(qū)與配體膠原結(jié)合的具體部位，我們選擇了DDR2胞外區(qū)全長含399個氨基酸的片段來表達，作為阻斷劑. 在以往研究DDR2胞外區(qū)功能的時候，我們也曾構建了幾種GST和6 His融合的DDRG2胞外區(qū)原核表達載體（4T1Ddrg2和pRsetADdrg2），但它們的表達形式無一例外均是包涵體. 利用包涵體的變性和復性進行純化，效果都不理想. 又考慮到變性和復性會影響DDRG2胞外區(qū)的結(jié)構與活性，于是我們便嘗試在畢赤酵母中表達DDRG2胞外區(qū)蛋白. 畢赤酵母表達系統(tǒng)是比較新的酵母外源蛋白表達系統(tǒng). 畢赤酵母表達質(zhì)粒通過同源重組整合入酵母

21、基因組而隨同酵母染色體一起復制. 同源重組時，畢赤酵母表達質(zhì)粒可以通過體內(nèi)和體外兩種方式多拷貝整合于畢赤酵母基因組中. 由于不同的基因具有不同的特性，在畢赤酵母中表達時，不同外源蛋白的表達水平可能會有很大的差異. 我們的實驗表明，DDR2DR在畢赤酵母表達系統(tǒng)中獲得了表達，表達產(chǎn)物經(jīng)過純化后得到了純度約為90.5的融合蛋白. 競爭結(jié)合實驗表明，融合蛋白HisDR在0.2 g/L的濃度下能完全阻斷II型膠原與細胞表面天然DDR2的結(jié)合. 雖然不能完全阻斷，但仍可以說明兩個問題：一是NIH 3T3細胞和RA滑膜細胞中的DDR2介導MMP1的表達或過表達；二是可溶性DDR2受體胞外區(qū)作為阻斷劑，可以

22、在一定程度下抑制這種表達. 【參考文獻】 1Vogel W. Discoidin domain receptors: Structural relations and functional implicationsJ. FASEB J, 1999, 13(Suppl): S77-S82. 2Alvcs F, Vogel W, Mossie K, Millauer B, et al. Distinct structural characteristics of discoidin I subfamily receptor tyrosine kinases and complementary ex

23、pression in human cancerJ. Oncogene, 1995, 10 (3): 609-618. 3Nemoto T, Ohashi K, Akashi T, et al. Over expression of protein tyrosine kinases in human esophageal cancerJ. Pathobiology, 1997, 65 (4):195-203. 4Weiner H L, Rothman M, Miller D C, et al. Pediatric brain tumors express receptor tyrosine kinases including novel cell adhesion kinasesJ.Pediatr Neurosurg,1996, 25(2): 64-72. 5Barker K T, Martindale J E, Mitchell P J, et al. Expression patterns of the novel recept