心肌肌鈣蛋白_的融合表達和分離純化

1、心肌肌鈣蛋白 的融合表達和分離純化勞興珍 1, 吳國球 2, 何 貝 斌綿 3, 沈子龍 3(1. 中國藥科大學 生物信息學教研室 , 江蘇 南京 210009; 2. 東南大學 附屬中大醫(yī)院 檢驗科 ,江蘇 南京 210009; 3. 中國藥科大學 生物技術中心 , 江蘇 南京 210009 摘 要 :目的 研究人心肌肌鈣蛋白 (cTn 在大腸桿菌中穩(wěn)定高效的融合表達和分離純化 , 以滿足臨床診斷 的需要 。 方法 人 cTn DNA 序列由 pd f 52cTn 質(zhì)粒經(jīng) PCR 亞克隆而得 , 然后將其插入 pET 32a (+ 載體 , 構(gòu)建成pET 32a (+ 2cTn 表達質(zhì)粒 ,

2、 以大腸桿菌 BL21(DE3 為表達菌 , 在 IPTG 誘導下進行表達 。 硫氧還蛋白 (T rxA 2cTn 融合蛋白得到高效表達 , 并經(jīng)金屬螯合親和色譜一步純化得到目的蛋白質(zhì) 白質(zhì)具有 cTn 免疫原活性 。 結(jié)論 構(gòu)建了 pET 32a (+ 2cTn 重組質(zhì)粒 , , 為建立急 性心肌梗死早期診斷試劑奠定了基礎 。 關鍵詞 :心肌肌鈣蛋白 ; 融合表達 ; ; 中圖分類號 :R542.22; R786 21678(2006 0320150203coli and affinity puri fication of troponin ing 2zhen 1, W U G uo 2qi

3、u 2, HE Y un 2mian 3, SHE N Z i 2long 3(1. o f Bioinformatics o f China Pharmaceutical Univer sity , Nanjing 210009, China ;2. Department o f Laboratory , the Affiliated Zhongda Hospital o f Southeast Univer sity , Nanjing 210009, China ;3. The Biotechnology Center o f China Pharmaceutical Univer si

4、ty , Nanjing 210009, China Abstract :PurposeThe present w ork was to express a stable heterolog ous human cTn fusion protein toT rxA as part of an overall strategy for the is olation and purification of enough material for use as a diagnostic calibrator. Methods The DNA sequence was is olated from t

5、he cDNA plasmid pdf 52cTn by PCR and cloned as a fusion to the C 2termius of T rxA and the recombinant cTn expression vector was constructed and ex 2pressed in host E. coli BL21(DE3 . R esults When induced with IPTG,the pET 32a (+ 2cTn was highly expressed in E. coli . The fusion protein was affinit

6、y 2purified over a Histrap C olumn. The troponin fusion protein was assayed and found to exhibit similar immunogenic response relative to natural cardiac troponin . Conclusion The results dem onstrated that T rxA 2cTn was success fully expressed. The recombinant cTn was applicable in early detection

7、 of acute my ocardial in farction.K ey w ords :cardiac troponin ; fusion expression ; IrxA ; acute my ocardial infarction ; affinity purifica 2tion收稿日期 :2005210218; 修回日期 :2005212214作者簡介 :勞興珍 (19782 , 女 , 廣西靈山人 , 碩士 , 助教 , 主要研 究方向為微生物與生化藥學 ; 沈子龍 (19402 , 男 , 通訊作者 , 教授 , 博 士生導師 , 主要研究方向為微生物與生化藥學 ,T el

8、 :025283271389。 1995年美國 FDA 批準心肌肌鈣蛋白 (cTn 作為急性心肌梗死 (AMI 的最新實驗診斷指標 。與其它指標相比 ,cTn 在血中出現(xiàn)持續(xù)的時間長 , 且 為心肌細胞所特有 。在心肌細胞膜完整的情況下 , cTn 不能透出細胞膜進入血循環(huán) 。當心肌細胞因 缺血 、 缺氧發(fā)生變性壞死時 ,cTn 可通過破損的細胞膜釋放入血 。 由于 cTn 相對分子質(zhì)量 (M r 較小 并持續(xù)從變性細胞中溢出 。因此對 AMI 診斷敏感 性高 , 特異性強 , 還可用于 AMI 的后期監(jiān)護 、 預后及 療效判斷 1。 用傳統(tǒng)的分離方法從人心肌組織中提 取 cTn 是非常困難的

9、 。為此 , 我們以 pET 32a (+ 為 cTn 克隆基因的表達載體 , 在大腸桿菌中經(jīng)誘 導后高效表達出 T rxA 2cTn 融合蛋白 , 為制備高質(zhì) 量質(zhì)控產(chǎn)品及建立相關的檢測方法打下基礎 。 1 材 料pdf 52cTn I 質(zhì)粒 , 中國藥科大學生物技術中心51中國生化藥物雜志 Chinese Journal of Biochem ical Pharmaceutics 2006年第 27卷第 3期構(gòu)建 ;pET 32a (+ , 美國 N ovagen 公司 ;JM109、 BL21 (DE3 , 中國藥科大學生物技術中心保存 ; dNTP 、 10 PCR 反應緩沖液 、 T

10、 aqDNA 聚合酶 、 限制性內(nèi)切酶 , 上 海生工生物技術 有 限 公 司 ; T 4DNA 連 接 酶 , 美 國 Promega 公司 ;cTn T est K it , 美國 C ortea Diagnostic 公 司 ;HisT rap kit ,Amersham 公司 ;Am pgene 4800PCR 儀 , 北京昊諾斯科技有限公司 ; 其它試劑均為國產(chǎn)或進 口分析純 。2 方 法2. 1 pET 32a (+ 2cTn 質(zhì)粒的構(gòu)建 2人 cTn DNA 序列由 pdf 52cTn 質(zhì)粒經(jīng) PCR 亞 克隆而得 。 PCR 的條件為 :pd f 52cTn 模板 1L , 1

11、0bu ffer 5L ,10m ol/L dNTP 1L ,T aq Plus 0. 5L , 引物各 1L , 最后加 1滴石蠟油 , 置于 PCR 儀 ,95 5min 變 性 后 , 執(zhí) 行 94 1min , 56 , 1min 程序 ,25個循環(huán)后 721. 2%設計有 Eco R , 先用 Eco R 和 Hin d 酶切 PCR pET 32a (+ 質(zhì)粒 , 分別回 收片段和載體 , 將此片段和載體按適當?shù)谋壤M行 連接 , 并轉(zhuǎn)化至 JM109宿主菌中 , 經(jīng)挑選得到陽性重 組質(zhì)粒 , 命名為 pET 32a (+ 2cTn 。2. 2 pET 32a (+ 2cTn 的表

12、達將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3 菌種 ,37 培養(yǎng) 過夜 , 以 1%的接種量轉(zhuǎn)接 , 培養(yǎng)至 A 600nm 值為 0. 6 0. 8時 , 加入終濃度為 1mm ol/L IPTG 進行誘導表 達 。 培 養(yǎng) 4h 后 , 離 心 收 集 菌 體 , 使 用 12%S DS 2 PAGE 檢測目的蛋白質(zhì) 。2. 3 T rxA 2cTn 融合蛋白的親和純化2. 3. 1 蛋白質(zhì)初提物的提取 將菌體懸浮于 20 mm ol/L T ris 2HCl (pH 8. 0 、 0. 5mm ol/L E DT A 緩沖液 中 。 冰 水 浴 上 超 聲 裂 菌 。待 菌 液 黏 度 下 降

13、后 ,10000r /min 離心 10min 收集菌液上清 。2. 3. 2 HisT rap kit 親和色譜 將細胞裂解液上清上 樣于已用平衡緩沖液 (pH 8. 0, 20mm ol/L T ris 2 HCl ,10mm ol/L 咪唑 預平衡過的親和柱 。上樣完 畢后 , 先用平衡緩沖液 充分洗柱 , 后分別用含 20, 40,60,100,300,500mm ol/L 咪唑的 20mm ol/L T ris 2 HCl (pH 8. 0 進行分步洗脫 。取少量供試品進行電 泳分析 。2. 4 以肌鈣蛋白膠體金診斷試劑盒檢測目的蛋白 質(zhì)免疫活性將菌體裂解液上清直接上樣于測試板的小孔

14、 內(nèi) , 同時含 pET 32a (+ 的 BL21(DE3 同樣進行細胞 破碎 , 并將菌體裂解液上清作為陰性對照 。3 結(jié) 果3. 1 pET 32a (+ 2cTn 表達載體的構(gòu)建將 cTn 基因克隆入 pET 32a (+ 的 Eco R 和 Hin d 位點 , 通過鋪板 、 培養(yǎng) 、 擴增 、 酶切等操作初選 出陽性克隆 , 酶切圖譜見圖 1, 重組質(zhì)粒由上海生物 工程有限公司進行測序 , 結(jié)果與預期序列一致 。(Eco R +Hin d ; 2. pET 32a (+ 2cTn 重組質(zhì)粒 以 Eco R +Hin d 進行雙酶切 ; 3,4. pET 32a (+ 2cTn 重組

15、質(zhì)粒分 別以 Eco R , Hin d 進行單酶切1. DNA markers (Eco R +Hin d ; 2. pET 32a (+ 2cTn recombinant plasm id digest by Eco R and Hin d ; 3,4. pET 32a (+ 2cTn recombi 2 nant plasm id digest by Eco R , Hin d ,respectively圖 1 pET 32a (+ 2cTn 重組質(zhì)粒的酶切分析Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET 32a (+ 2cTn r

16、ecombinant plasmid3. 2 目的蛋白質(zhì)的誘導表達和純化挑取重組菌單菌落在 LB 中 37 培養(yǎng)過夜 , 以 1%的接種量轉(zhuǎn)接 , 培養(yǎng)至 A 600nm 值為 0. 60. 8時 , 加入終濃度為 1mm ol/L 的 IPTG, 繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后 , 離心收集菌體 , 使用 12%SDS 2PAGE 檢測目的蛋白 質(zhì) 。 電泳結(jié)果顯示 :與對照組相比 , 發(fā)現(xiàn)有新的蛋白 質(zhì)條帶產(chǎn)生 (圖 2 。觀察發(fā)現(xiàn) , 加入 IPTG 誘導后 , 轉(zhuǎn)入空載體的細菌總蛋白質(zhì)提取物中出現(xiàn) 1個 M r 為 20000的新蛋白質(zhì) , 而轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒 pET 32a (+ 2 cTn 的細菌

17、總蛋白質(zhì)提取物中出現(xiàn)的新蛋白質(zhì) M r 為 44000左右 。 分析認為 , 空載體上產(chǎn)生的蛋白質(zhì) 是 T rxA , 而重組質(zhì)粒 pET 32a (+ 2cTn 質(zhì)粒中產(chǎn)生 的蛋白質(zhì)是 T rxA 2cTn 融合蛋白 。進一步的分析證 明目的蛋白質(zhì)大部分以裂解液上清形式存在 。 結(jié)果 表明載體構(gòu)建成功 , 而且適用于蛋白質(zhì)的高效可溶 性表達 。細胞裂解液上清經(jīng)親和柱分步洗脫后 , 純化的 T rxA 2cTn 融合蛋白主要位于 300mm ol/L 咪唑洗脫 峰中 , 達到電泳純 (圖 3 。3. 3 T rxA 2cTn 的免疫活性陽性菌落經(jīng) IPTG 誘導后 , 離心得到菌體并破碎 獲得

18、上清后 , 由肌鈣蛋白膠體金診斷試劑盒檢測到 151中國生化藥物雜志 Chinese Journal of Biochem ical Pharmaceutics 2006年第 27卷第 3期cTn 蛋白免疫原活性 (圖 4 。證明了目的蛋白質(zhì)得到正確表達 。1. 誘導前全菌 ; 2. 含 pET 32a (+ 質(zhì)粒的誘導后全菌 ; 3. 含 pET 32a (+ 2cTn 重組質(zhì)粒的誘導后全菌 ; 4. 中 M r 標準蛋白質(zhì) 1. Uninducted lysate of BL21; 2. Inducted lysate of BL21DET32a (+ ; 3. Inducted lysa

19、te of BL21pET32a (+ 2cTn ; 4. Protein marker 圖 2 Fig 2 S DS 2PAGE analysis of protein before induction 1. 中 M r 標準蛋白質(zhì) ; 2. 純化的 T rxA 2cTn 融合蛋白 1. M edium protein marker ; 2. Purified T xA 2cTn fusion protein圖 3 純化蛋白質(zhì)的電泳分析Fig 3 S DS 2PAGE analysis of purified fusion protein4 討 論本文采用的原核表達載體 pET 32a (+

20、 , 含 T 7啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號 , 其特點除了能夠編碼 6個 組氨酸殘基外 , 還帶有大腸桿菌硫氧還蛋白 (T rxA 基因 。 T rxA 基因編碼 109個氨基酸的硫氧還蛋白 。 硫氧還蛋白是低 M r 的氧化還原酶 , 在蛋白質(zhì)折疊 過程中可催化二硫鍵的正確形成 , 對大腸桿菌表達 的重組蛋白質(zhì)正確折疊更為有效 , 從而增加蛋白質(zhì) 的可溶性 324。外源基因經(jīng)多克隆位點插入后與 T rxA 一起融合表達 , 外源蛋白質(zhì)與硫氧還蛋白融合 表達不僅提高了表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性 , 而且由于 M r1. 以含 pET 32a (+ 質(zhì)粒誘導后菌體的破碎后上清為陰性對照 ; 2.含重組質(zhì)粒誘導后

21、全菌體的破碎后上清1. Inducted lysate of BL21pET 32a ( as native control ; 2. Inductedlysate of 32a (+ 2cTn 4 assay of fusion proteinS 2分析時更容易鑒定 。此外 , 外源別位點 , 從而使外源蛋白質(zhì)與硫氧還蛋白的分離變 得方便 。游離的 cTn 在血液中很不穩(wěn)定 526, 易降解 , M r 較小 , 因此把 cTn 基因融合在 T rxA 基因的下 游 , 表達成較大 M r 的融合蛋白質(zhì) , 增加其穩(wěn)定性 。 這一目的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中得到高效表達以及快 速純化 , 為以后制

22、作 E LIS A 快速診斷試劑盒奠定了 基礎 。 參考文獻 :1 Wu A H ,Feng YJ ,John H C ,et al. C om paris on of my oglobin ,creatinekinase 2M B ,and cardiac troponin for diagnosis of acute my ocardial in farction J.Ann Clin Lab Sci ,1996,26(4 :2912300.2 M ark H ,Linda T ,Julie W ,et al. Expression in E scherichia coli andaffinity purification of a CK S 2T roponin fusion protein J.Protein Express Purif ,1995,6(3 :2562264.3 LaVallie E R ,Diblasio E A , K ovacic S ,et al. A thioredoxin gene f