發(fā)酵菌種來源

1、發(fā)酵菌種的來源與選育發(fā)酵菌種的來源與選育第一節(jié)第一節(jié) 菌種的來源菌種的來源 根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買； 從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 從自然界篩選從自然界篩選自然界中菌種分離的一般過程土樣的采取土樣的采取 預(yù)處理預(yù)處理 培養(yǎng)培養(yǎng) 菌落的選擇菌落的選擇 產(chǎn)品的鑒定產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題問題：分離思路分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)

2、的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。 實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。 定方案：定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。 采樣：采樣：有針對性地采集樣品。 增殖：增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。 分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。 發(fā)酵性能測定：發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。新菌

3、種分離與篩選的步驟新菌種分離與篩選的步驟 （一）采樣一）采樣1、采樣對象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣和采集方法采樣和采集方法 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。 樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；

4、3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的； 5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長1 1土樣采集方法土樣采集方法 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集； 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面515cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 在采集植物根際土樣時，一

5、般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。2 2植物體采集方法植物體采集方法 在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。 選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。 采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。 3 3水樣采集方法水樣采集方法 用于細(xì)菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。 由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在

6、較深的靜水層中采集水樣。 方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4下貯存。（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得

7、多。（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)分離 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，因此，建立一更為科學(xué)的和針對性強的分離方法是必要的。 分離富集方法分離富集方法 運用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。 富集可以促進抗性的產(chǎn)生并維持下來。 土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。 植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂

8、布平板。 水中細(xì)菌的分離：水樣通過0.22m無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。次代培養(yǎng)及純化步驟次代培養(yǎng)及純化步驟 1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。2 通過高倍放大進行鏡檢，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進行分類。次代培養(yǎng)及純化步驟次代培養(yǎng)及純化步驟2、將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進行最初分組。4、將認(rèn)為

9、有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選。（四）篩（四）篩 選選 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。生產(chǎn)選種生產(chǎn)選種 是在長年累月的生產(chǎn)實踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進行類似新種篩選分離，達到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。（五）毒性試驗（五）毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤

10、其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)菌種的育種工業(yè)菌種的育種 是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。菌株選育的目的q 提高生產(chǎn)能力提高生產(chǎn)能力q 提高產(chǎn)品質(zhì)量提高產(chǎn)品質(zhì)量q 開發(fā)新產(chǎn)品開發(fā)新產(chǎn)品q 解決生產(chǎn)實際問題解決生產(chǎn)實際問題q 防止菌種退化防止菌種退化基因突變： 自然選育、誘變育種基因重組： 雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進

11、化： 點突變、易錯PCR、同序法DNA Shuffling等工業(yè)菌種育種的方法工業(yè)菌種育種的方法自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為1010-8-81010-9-9自然突變有兩種情況自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。這種突變成為正突變。一、自然選育一、自然選育自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育在工業(yè)

12、生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施。高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變回復(fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變情況我們稱為回復(fù)突變問題：問題： 高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？自然選育操作步驟：自然選育操作步驟： 一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞單細(xì)胞(孢子孢子)懸液的制備懸液的制備平板分離平板分離挑選

13、單菌落挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗發(fā)酵試驗誘變育種誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，進行的篩選，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變劑：誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑誘變劑物理物理化學(xué)化學(xué) 一、誘變劑和誘變處理 物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全?；瘜W(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等

14、?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。 化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎.二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選( (一一) )出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次

15、誘變能積累較多的提高。4出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 5要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 ( (二二) )處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。( (三三) )誘變處理誘變

16、處理 根據(jù)有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。 化學(xué)誘變劑使用過程的安全性化學(xué)誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇 ( (四四) )中間培養(yǎng)中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。 方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時存在于

17、一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。( (五五) )分離和篩選分離和篩選 篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。 復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性?；蛴N基因育種 基因重組

18、育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細(xì)胞的方法?；虻闹苯舆M化基因的直接進化(directed evolution)(directed evolution)q 突變 基因突變庫的建立基因突變庫的建立q 篩選 基因突變庫的篩選基因突變庫的篩選q 基因復(fù)制與遺傳步驟： 在分子水平上，對目標(biāo)基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。選擇育種方法時綜合考慮的因素選擇育種方法時綜合考慮的因素 (1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)； (2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認(rèn)識的明了程度； (3)經(jīng)濟費用。 如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚