基因表達譜分析技術(shù)

1、基因表達譜分析技術(shù)1 微陣列技術(shù)（ microarray ） 這是近年來發(fā)展起來的可用于大規(guī)?？焖贆z測基因差別表達、基因組表達譜、 DNA 序列 多態(tài)性、致病基因或疾病相關(guān)基因的一項新的基因功能研究技術(shù)。其原理基本是利用光導(dǎo)化 學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術(shù) , 在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸“探針”（cDNA ESTs或基因特異的寡核苷酸），并與放射性同位素或熒光物標記的來自不同 細胞、組織或整個器官的 DNA或 mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈 cDNA進行雜交，然后用特殊的檢 測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析。其優(yōu)點是可以同時對大量基因，甚至整個基因組的基因 表達進行對比分析。

2、包括 cDNA芯片（cDNA microarray ）和 DNA芯片（DNA chips）。cDNA芯片使用的載體可以是 尼龍膜，也可以是玻片。當使用尼龍膜時，目前的技術(shù)水平 可以將20000份材料點在一張12cmx 18cm的膜上。尼龍膜上所點的一般是編好順序的變性了 的雙鏈cDNA片段。要得到基因表達情況的數(shù)據(jù)，只需要將未知的樣品與其雜交即可。雜交的結(jié)果表示這一樣品中基因的表達模式，而比較兩份不同樣品的雜交結(jié)果就可以得到在不同樣 品中表達模式存在差異的基因。雜交使用的探針一般為mRNA勺反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，標記探針使用32PdATP。 如果使用玻片為載體，點陣的密度要高于尼龍膜。 雜交時使用兩種不

3、同顏色的熒光標記不同的兩份樣品，然后將兩份樣品混合起來與一張芯片雜交。洗去未雜交的探針以后， 能夠結(jié)合標記cDNA的點受到激發(fā)后會發(fā)出熒光。 通過掃描裝置可以檢測各個點發(fā)出熒光的強 度。對每一個點而言， 所發(fā)出的兩種不同熒光的強度的比值， 就代表它在不同樣品中的豐度。 一般來講，顯示出來的圖像中，黃色的點表示在不同的樣品中豐度的差異不大，紅色和綠色 的點代表在不同樣品中其豐度各不相同。使用尼龍膜為載體制作 cDNA芯片進行研究的費用要比玻片低，因為尼龍膜可以重復(fù)雜交。檢測兩種不同的組織或相同組織在不同條件下基因表 達的差異，只需要使用少量的尼龍膜。但是利用玻片制作的 cDNA芯片靈敏度更高，而

4、且可以使用 2 種探針同時與芯片雜交，從而降低了因為雜交操作帶來的差異；缺點是無法重復(fù)使用 還必須使用更為復(fù)雜的儀器。Guo等（2004）將包含104個重組子的cDNA文庫點在芯片上，用于檢測擬南芥葉片衰老 時的基因表達模式，得到大約6200差異表達的ESTs對應(yīng)2491個非重復(fù)基因。其中有 134個基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，182個基因預(yù)測參與信號傳導(dǎo)，如MAPK級聯(lián)傳導(dǎo)路徑。Li等（2006）設(shè)計高密度的寡核苷酸 tiling microarray 方法，檢測秈稻全基因組轉(zhuǎn)錄表達情況。芯片上 包含 13,078,888 個 36-mer 寡核苷酸探針，基于秈稻全基因組 shot-gun 測序的序列

5、合成， 大 約 81.9%（35,970）的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄事件。 Hu 等（2006）用含有 60,000 寡核苷酸探針（代表 水稻全部預(yù)測表達基因）的芯片檢測抗旱轉(zhuǎn)基因植株（過量表達SNAC1水稻）中基因的表達情況，揭示大量的逆境相關(guān)基因都是上升表達的。2 基因表達系列分析（ Serial analysis of gene expression,SAGE）基因表達系列分析（SAGE是一種轉(zhuǎn)錄物水平上研究細胞或組織基因表達模式的快速、 有效的技術(shù)，也是一種高通量的功能基因組研究方法，它可以同時將不同基因的表達情況進 行量化研究（Velculescuet al., 1995）。SAGE的基本原理是

6、：每一條 mRNA序列都可以用它包含的9bp的小片段（TAG代替，因此考查這些TAGs出現(xiàn)的頻率就能知道每一種mRNA的豐度。首先利用生物素標記的oligo （dT）引物將mRN反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA然后利用NlaHI酶切雙鏈cDNA NlaIII酶的識別位點只有 4bp,因此cDNA都被切成幾十 bp的小片段。帶有 生物素標記的小片段 cDNA被分離出來，平均分成 2份。這2份cDNA分別跟2個接頭連接， 2個接頭中均有一個 FokI酶切位點。FokI是一種II S型核酸內(nèi)切酶，其識別位點不對稱， 切割位點位于識別位點下游9bp且不依賴于特異的 DNA序列。FokI酶切分成2份的cDNA之 后

7、，帶有部分接頭序列的 TAGS就被釋放下來。這時將 2份cDNA昆合起來，進行連接反應(yīng)。根據(jù)接頭序列設(shè)計引物擴增連接反應(yīng)的產(chǎn)物，然后通過NlaHI酶切PCR產(chǎn)物得到連接在一起的兩個TAG即ditag 。將ditags串連起來，克隆到質(zhì)粒載體中。一般每個克隆包含50個左右的ditags。這些克隆經(jīng)過 PCR擴增然后測序。因為每一個ditag之間都是以NlaHI識別位點間隔的，所以很容易對每個的 ditag進行區(qū)分和計數(shù)。而每一個TAG在 SAGE庫中出現(xiàn)的 頻率就代表了該基因的表達水平。利用SAGE可以在短期內(nèi)得到豐富的表達信息，與直接測定cDNA克隆序列方法相比，減少了大量的重復(fù)測序，從而大大

8、節(jié)省了研究時間和費用。這種方 法對正常、癌基因旁、癌組織中基因的差異表達研究方面還有獨到的優(yōu)點，有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤 特異基因。首次運用SAGE技術(shù)是分析1000個胰腺基因的表達情況(Velculescu et al., 1995), 結(jié)果都顯示它是一種有效的功能基因組研究方法。最早用SAGE技術(shù)進行研究的高等植物是水稻(Matsumura et al., 1999)。運用SAGE技術(shù)檢測了水稻中來源于6000個基因10000個TAGs SAGE分析顯示絕大部分高表達基因都是看家基因，這些基因的mRNA在總RNA中的比例超過1%。在無氧處理和對照的幼苗中分析了2000個左右的TAGs結(jié)果顯示多數(shù)基因

9、的表達沒有變化。有趣的是，發(fā)酵途徑相關(guān)的基因同樣沒被檢測到。根據(jù)TAG序列設(shè)計引物，成功擴增出了延伸因子EF-1a 0.2kb的cDNA片段。這一事實說明利用9bp的TAG序列和4bp的Nlalll識別位點序列，可以設(shè)計引物用于長片段cDNA的獲得。3 cDNA-AFLPcDNA-AFLP是從基因組 AFLP方法(Vos et al., 1995)發(fā)展來的 RNA旨紋技術(shù)。經(jīng) 典的 cDNA-AFLP按照標準的AFLP方法進行操作，只不過模板變成了 cDNA這一方法包含3個步驟： a.將cDNA酶切并連上載體；b.利用包含選擇性堿基的引物進行擴增；c.電泳及成像。一般選擇兩種限制性內(nèi)切酶進行c

10、DNA的消化，這兩種酶一種的酶切位點為4個堿基，另一種為 6個堿基。在植物基因組的 AFLP操作中，需要添加 3個進行選擇性擴增。因為cDNA的復(fù)雜性比基因組低，所以 cDNA-AFLP中每個引物只需要 2個選擇性堿基。聚丙烯酰胺凝膠電泳中， 最大的cDNA-AFLP產(chǎn)物為1000bp左右，最小將近 100bp。對馬鈴薯的已知cDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，cDNA-AFLP中常用的兩種酶只能同時切割大約45%的cDNA如果使用這種方法，幾乎一半的基因的表達情況是無法被揭示出來的，因此對cDNA-AFLP方法進行了修改，在cDNA的酶切時僅僅采用單酶切，這就是單酶切的cDNA-AFLP技術(shù)(Habu e

11、t al.,1997)。1999年，Kawamoto等人進一步發(fā)展了這項技術(shù)，他們稱之為iAFLP技術(shù)。利用該技術(shù)可以同時檢測多個樣本的基因表達差異。cDNA-AFLP技術(shù)在植物中的首次運用，是Bache 口等(1996)對馬鈴薯基因表達差異的研究。該研究分離到兩個在馬鈴薯塊莖形成過程中差異表達的cDNA片段。這兩個基因的轉(zhuǎn)錄都是塊莖特異性的； 它們在 15天的塊莖中高度表達, 但在其它組織中表達量很低。 此后無論在 分離抗逆相關(guān)基因的研究也有成功的報道( Ivashuta et al.,1999)。4 差異展示 PCR( DifferentialDisplay Reverse Transcr

12、iption PCR, DDRT-PC)RDDRT-PCR1基于反轉(zhuǎn)錄和 PCR的功能基因組研究方法，最早由Liang和Pardee (1992)報道。這種方法能有效地檢測真核細胞中特定基因的表達模式,因而可以用于發(fā)現(xiàn)和克隆新 的基因。DDRT- PCR技術(shù)的基本原理是擴增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到分子量大小不同的cDNA片段。首先利用oligo (dT)引物反轉(zhuǎn)錄 mRNAI到cDNA然后利用相同的 oligo (dT)引物和另一隨 機引物進行PCRF增。到目前為止該技術(shù)已經(jīng)得到了大量的改進。為了提高特異性，可以增 加隨機引物的特異性。堿基數(shù)增加以后，有可能包含某一特異基因家族的保守序列，這使得 檢測某

13、一類基因的表達情況成為現(xiàn)實。分離DDRT-PCR勺產(chǎn)物簡單易行，可以通過變性或非變 性的聚丙烯酰胺凝膠電泳( Liang et al., 1995)、毛細管電泳( George et al., 1997)或 普通瓊脂糖電泳獲得。DDRT-PCR產(chǎn)物的標記，可以使用33PdATP (Simon and Oppenheimer, 1996)、熒光( Jones et al., 1997)或銀染( Gottschlich et al., 1997)。因為這種方法非常簡便，所以它得到了廣泛的應(yīng)用。自從該方法被發(fā)明以來，已有許多成功的報道，應(yīng)用范圍包括從微生物到人類的各個物種。在植物中運用DDRT-PC

14、R法得到了大量的cDNA克隆，從擬南芥中得到了一些控制生物鐘的基因(Kreps et al., 2000)，從大麥野生型品種和無根毛的突變體中克隆了一個控制根毛形成的基因HvEXPB(1 Bratanich andBlanchetot, 2006)。該技術(shù)在生物對逆境條件適應(yīng)的研究中同樣得到了廣泛的應(yīng)用，為了弄清楚在多系統(tǒng)衰竭綜合癥中豬圓環(huán)病毒n型侵入時發(fā)生的細胞學事件，利用DDRT-PC鑒定了一些淋巴細胞內(nèi)受此病誘導(dǎo)而的靶分子，其中兩個差異調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本顯示與人的基因有一定同 源性，分別是 RNA剪接因子和透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運動受體(Kwasniewskiand Szarejko, 2006)。5

15、抑制消減雜交( Suppression Subtractive Hybridization,SSH)SSH方法是一種簡便而高效地尋找差異表達基因的新方法。該方法是以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交方法。所謂抑制PCR是利用非目標序列片段兩端的長反向重復(fù)序列在退火 時產(chǎn)生“鍋柄”結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制非目標序列的擴增。 SSH 方法既 利用了消減雜交技術(shù)的消減富集，又利用抑制PCR進行了高效的復(fù)性動力學富集。其全部流程包括4個主要步驟：a.分別反轉(zhuǎn)錄tester和driver的mRNA!到雙鏈cDNA然后利用RsaI 酶切cDNA并將酶切的tester cDNA加上接頭。b.用

16、大大過量的 driver與tester進行兩輪 雜交，對雜交產(chǎn)物進行抑制PCRF增。c.將PCR產(chǎn)物克隆進質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化后挑取文庫。d.對SSH文庫進行篩選。抑制差減雜交法不僅能分離高豐度差異表達基因， 而且能有效富集低豐度差異表達基因。 1996年Diatchenko等人構(gòu)建了第一個 SSH文庫，并通過與人類 Y染色體的Cosmid文庫雜交 證實了該方法的有效性。運用該技術(shù)僅通過一輪反應(yīng)既可使特異表達的基因富集1000 倍以上。過去幾十年來，抑制差減雜交法廣泛運用于動植物、微生物研究。在植物中主要用于組 織器官、發(fā)育階段和逆境差異表達基因的篩選( Gepstein et al., 2003;

17、 Chu et al., 2004; Zeng et al., 2006)。 Gepstein 等(2003)利用該方法從擬南芥中得到了約800 個自然衰老相關(guān)的cDNA片段，Chu等(2004)使用該技術(shù)鑒定了702個與xa13介導(dǎo)的抗病反應(yīng)相關(guān)的ESTs到目前為止，SSH方法得到了很多改進和完善。為了進一步消除SSH中的背景，Rebrikov 等( 2000)提出了基于 MOS(Mirror orientation selection )的抑制消減雜交，有效的提 高了篩選效率。Ze ng等(2006)將SSH和cDNAMicroarray 技術(shù)聯(lián)合運用，從棉花中篩選到 了 242個體細胞胚胎形成相關(guān)的cDNA片段，進一步證實了該方法的實用性。以上幾種都是高通量篩選特異表達基因的方法，但是同時給我們帶來大量重復(fù)或無意的 數(shù)據(jù)。帶來這一問題的一個原因是因為一種mRNA能產(chǎn)生不止一個信號。我們構(gòu)建的cDNA文庫和制作的cDNA芯片，都不可避免地會包含重復(fù)克隆。而如果我們使用單酶切cDNA-AFLP那么每一條mRNA都最終會形成不止一條條帶(Habu et al., 1997)。當然隨著技術(shù)地改進， cDNA-AFLP中的冗余信息有可能被徹底除去(Matz et al.,1999)。但是DDRT-PCF的特點卻決定了它一定會有重復(fù)數(shù)據(jù)。因為每一條mRNAi常都會跟不止一對