抑制Ras 信號(hào)通路可減弱小鼠胚胎干細(xì)胞的造血分化

1、抑制Ras 信號(hào)通路可減弱小鼠胚胎干細(xì)胞的造血分化    作者：王曉燕劉兵要暉宇侯寧楊曉于曉?毛寧    【摘要】 為了探討Ras信號(hào)通路對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cells, ES cells)造血分化的影響，將突變型基因RasN17轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，免疫印跡檢測(cè)RasN17的表達(dá)對(duì)Erk1/2及Akt磷酸化的作用，應(yīng)用半定量RT?PCR檢測(cè)ES細(xì)胞在分化過(guò)程中與造血相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果表明：Ras N17的表達(dá)能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，攜帶RasN17基因的ES細(xì)胞在分化過(guò)程中

2、Runx1 、SCL 及beta?major珠蛋白等基因的表達(dá)被顯著抑制， 而FLK1的表達(dá)不受影響。結(jié)論：ES細(xì)胞體外造血分化需要Ras通路的活化。    【關(guān)鍵詞】 胚胎干細(xì)胞； 造血分化； Ras Suppression of Ras Mediated Signaling Attenuates Hematopoietic Diffe?rentiation of Embryonic Stem Cells of Mice In Vitro    Abstract    To

3、 investigate the possible involvement of Ras signaling in the hematopoietic differentiation of embryonic stem cells (ES cells), ES cells were transfected with RasN17, the dominant?negative mutant of Ras. Western blot was used to test the effect of RasN17 expression on Erk1/2 and Akt phosphorylation,

4、 semi?quantitative RT?PCR was used to detect expression of gene related to hemalopoiesis in differentiation of ES cells. The results showed that the expression of RasN17 in the ES cells remarkably downregulated the phosphorylation of Erk1/2 and Akt simultaneously. Moreover, the expression of several

5、 markers related with hematopoiesis including Runx1, SCL and beta?major globin， were significantly suppressed in the EB expressing RasN17, whereas the transcription of Flk1, a gene required earlier than SCL in development of hematopoietic and endothelial lineages, was not influenced. It is concluded

6、 that the activation of Ras is pivotal for in vitro hematopoietic differentiation of ES cells.    Key words    embryonic stem cell; hematopoiesis differentiation; Ras    Ras是由1條多肽鏈組成的低分子量蛋白，由原癌基因ras編碼而命名，包括K?，N?，H? 3種類型。Ras的活性取決于其與GTP及GDP的結(jié)

7、合，與前者的結(jié)合是其活化形式。 它是MAPK(Erk1/2)及PI3K等信號(hào)通路上游的重要組成成分，并通過(guò)參與調(diào)控這些信號(hào)通路而影響細(xì)胞的增殖與分化。最近研究發(fā)現(xiàn)，Ras及其下游信號(hào)分子均參與調(diào)控小鼠的胚胎發(fā)育，并且不同類型的Ras對(duì)胚胎發(fā)育特別是造血發(fā)育發(fā)揮不同的調(diào)控作用1。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES cell)是一種具有全能分化特性的細(xì)胞，其體外造血分化可以模擬并重現(xiàn)體內(nèi)胚胎造血過(guò)程。報(bào)道表明：Ras及其下游的信號(hào)通路對(duì)ES細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中全能性的維持非常重要2。但Ras蛋白能否調(diào)控小鼠ES細(xì)胞體外造血分化并不明確。為此，本研究探討了Ras信號(hào)通路阻斷對(duì)E

8、S細(xì)胞造血分化的影響。    材料和方法    材料    DMEM、IMDM、胎牛血清、L?谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均為Hyclone公司產(chǎn)品。硫代甘油（MTG）為Sigma公司產(chǎn)品。丙酮酸鈉、無(wú)蛋白雜交瘤培養(yǎng)液（PFHM ）購(gòu)自Gibco?BRL公司。小鼠白血病抑制因子（mLIF）購(gòu)自Chemicon公司。小鼠干細(xì)胞因子（SCF）為PeprotTech公司產(chǎn)品。小鼠將CCE細(xì)胞接種于Co60照射后的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上，于5% CO2、飽和濕度、37條件

9、下進(jìn)行維持培養(yǎng)。維持培養(yǎng)體系組成為：DMEM 含15%胎牛血清、2 mmol/L L?谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 mol/L MTG 及mLIF 1 000 U/ml。在造血分化培養(yǎng)前48小時(shí)將細(xì)胞傳代于預(yù)分化培養(yǎng)體系，即將維持培養(yǎng)體系內(nèi)DMEM更換為IMDM，其他成分不變。預(yù)分化培養(yǎng)48小時(shí)后按常規(guī)傳代收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞按2×103接種于直徑35 mm的Petri dish，培養(yǎng)體系為：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纖維素、2 mmol/L L?谷氨酰胺、150 mol/L MTG、1 mmol/L的丙酮酸鈉、2 mmol/L PFHM、50 n

10、g/ml的SCF，培養(yǎng)條件同維持培養(yǎng)。    ES細(xì)胞的pCMV?RasN17及 pCMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染    質(zhì)粒pCMV?RasN17購(gòu)自Clontech公司，pCMV質(zhì)?？蛰d體為本室構(gòu)建并鑒定。傳代貼壁培養(yǎng)12小時(shí)的ES細(xì)胞應(yīng)用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司產(chǎn)品)按說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后傳代于含neo基因的MEF（neo?MEF）之上，并同時(shí)加800 g/ml的G418篩選陽(yáng)性克隆。 7 天后挑取不同細(xì)胞克隆擴(kuò)增后鑒定外源基因的表達(dá)。   

11、0;相關(guān)基因的RT?PCR檢測(cè)    TRIzoL（Sigma公司產(chǎn)品）提取細(xì)胞總RNA，按AMV及Ex Taq試劑盒 (TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行半定量RT?PCR以檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，即每份樣本分別取0.02 g（0.01×），0.2 g（0.1×），2 g（1×）RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后取1 l的cDNA進(jìn)行30循環(huán)的PCR。引物序列、退火溫度及所擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度見附表。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描電泳條帶。    Western blot 

12、60;  ES細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后離心洗滌，應(yīng)用維持培養(yǎng)體系貼壁再培養(yǎng)45分鐘后收集懸浮細(xì)胞并用PBS洗滌； EB按上述分化方法培養(yǎng)并收集。以上樣品加入細(xì)胞裂解液（Bio?Rad）置冰上反復(fù)吹打裂解，煮沸5-10分鐘，10 000×g，4離心10分鐘，取上清，應(yīng)用Pierce公司試劑盒(BCATM Protein Assay Kit)測(cè)蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶，0.1% tween?20的TBS（TBST）封閉1小時(shí)， 用TBST洗膜，5分鐘，共3次。之后分別按說(shuō)明書用一抗、二抗（Cell Sig

13、naling）孵育帶有目的蛋白的硝酸纖維素膜。按檢測(cè)試劑盒（Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce）說(shuō)明書檢測(cè)目的蛋白。    結(jié)    果    ES細(xì)胞分化過(guò)程中Ras下游的MAPK和PI3K通路發(fā)生活化    收取ES細(xì)胞及分化不同時(shí)間的EB進(jìn)行Western blot的檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。ES細(xì)胞內(nèi)MAPK通路的Erk1/2及PI3K下游的Akt處于高

14、水平磷酸化狀態(tài)，可能是由于維持培養(yǎng)過(guò)程中加入的LIF可以激活這兩條通路所致3。而分化第6天的EB內(nèi)Erk1/2及Akt的磷酸化水平同前一時(shí)間點(diǎn)相比有顯著升高。與此相對(duì)應(yīng)，永久造血分化在第6天時(shí)發(fā)生。以上結(jié)果提示，作為上游信號(hào)的Ras可能通過(guò)活化這兩條通路參與調(diào)控ES細(xì)胞的造血分化。    Figure 1. Activation of Erk1/2 and Akt during EB differentiation. ES and EB cells harvested at the indicated time points were subjected

15、 to Western blot.    RasN17在ES細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)下調(diào)MAPK(Erk1/2)及Akt的磷酸化水平    RasN17屬于H?Ras，其第17位的Ser被突變成Asp，它的表達(dá)可使細(xì)胞內(nèi)源性Ras失活，從而阻斷Ras參與的信號(hào)通路的活化，起到與基因敲除類似的效應(yīng)。應(yīng)用Lipofectamine2000將質(zhì)粒pCMV?RasN17及pCMV轉(zhuǎn)染CCE，經(jīng)G418篩選后Neo基因的表達(dá)及Ras蛋白表達(dá)量的上調(diào)標(biāo)志轉(zhuǎn)染成功(圖2A、 B)。Nanog和Oct4的表達(dá)是ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的兩個(gè)重要

16、標(biāo)志，這兩個(gè)基因的表達(dá)說(shuō)明RasN17不影響ES細(xì)胞的維持培養(yǎng)(圖2A)。ES細(xì)胞的克隆形態(tài)也不受RasN17的影響(圖3A，D，G)，ALP是ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的另外一個(gè)標(biāo)志，它的表達(dá)同樣說(shuō)明RasN17不影響ES細(xì)胞的維持培養(yǎng)（圖3B，E，H）。如圖2B所示，轉(zhuǎn)染RasN17后ES細(xì)胞內(nèi)Erk1/2 及Akt的磷酸化水平同時(shí)降低，說(shuō)明其能夠同時(shí)抑制MAPK及PI3K兩條通路的活化。    RasN17表達(dá)下調(diào)ES細(xì)胞分化過(guò)程中造血相關(guān)基因的表達(dá)水平    提取分化7天的EB細(xì)胞總RNA進(jìn)行半定量RT?PCR

17、，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染RasN17的ES細(xì)胞在形成的EB的分化過(guò)程中，Runx1、scl基因、beta?major珠蛋白的表達(dá)下調(diào)(圖4)， 而Flk?1的表達(dá)沒有明顯變化。可見，RasN17可以下調(diào)ES細(xì)胞造血分化過(guò)程中某些相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及分化標(biāo)記的表達(dá)，提示Ras通路的活化為ES細(xì)胞正常造血分化所必需。    討    論    Ras下游信號(hào)通路包括MAPK（Erk1/2）及PI3K通路等。Ras活化后可以通過(guò)激活其下游不同的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)ES細(xì)胞自我更新與分化2。Erk1/2

18、的活化促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞的分化并且是ES細(xì)胞分化所必需的2，當(dāng)Erk1/2的活化被阻斷后，小鼠ES細(xì)胞在體外分化過(guò)程中不能形成中胚層及胚外內(nèi)胚層，則ES細(xì)胞不能形成正常的EB4,5。PI3K通路的活化不僅為ES細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中全能性的維持所必需3，同時(shí)也是ES細(xì)胞正常分化所必需的。例如， bFGF激活的PI3K通路參與ES細(xì)胞向EB分化過(guò)程中中胚層的形成6。此外，PI3K通路的活化參與調(diào)控小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的永久造血分化，當(dāng)將該通路上游的p85基因敲除后，小鼠胎肝紅系造血發(fā)生缺陷7。由此可見，Ras可通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路來(lái)影響ES細(xì)胞體外正常分化及小鼠胚胎的正常發(fā)育。  &

19、#160; ES細(xì)胞體外可以分化產(chǎn)生各系造血細(xì)胞，其造血分化過(guò)程可以模擬并重現(xiàn)小鼠胚胎造血發(fā)育。ES細(xì)胞造血分化過(guò)程伴隨諸多造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及蛋白的表達(dá)，這些因子的表達(dá)既可作為造血分化的標(biāo)志同時(shí)又是正常造血分化所必需的。其中，Runx1是一種與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)是小鼠胚胎造血發(fā)育過(guò)程中永久造血開始的標(biāo)志之一。runx1-/-小鼠胚胎的永久造血缺失8；runx1基因的丟失同樣可以阻斷ES細(xì)胞體外分化過(guò)程中永久造血細(xì)胞的產(chǎn)生8,9。scl（stem cell leukemia）基因在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中為中胚層向造血細(xì)胞分化所必需。該基因缺失可導(dǎo)致胚胎由于造血分化異常而死亡，sc

20、l 基因缺失后ES細(xì)胞不能進(jìn)行造血分化10。beta?major 珠蛋白是永久紅細(xì)胞的標(biāo)志。Flk?1是VEGF的受體之一，在小鼠胚胎發(fā)育早期的中胚層細(xì)胞開始表達(dá)，其缺失導(dǎo)致胚胎發(fā)育過(guò)程中卵黃囊血島不能形成，同時(shí)血管系統(tǒng)的發(fā)育出現(xiàn)異常11。我們的結(jié)果顯示，RasN17可以下調(diào)ES細(xì)胞造血分化過(guò)程中Runx1、 scl及beta?major珠蛋白的表達(dá)，這表明Ras通路的活化是ES細(xì)胞造血分化所必需的。    與以往報(bào)道RasN17只阻斷Erk1/2通路5不同，本研究中轉(zhuǎn)染RasN17的ES細(xì)胞內(nèi)Erk1/2及Akt磷酸化水平同時(shí)降低的結(jié)果表明：RasN1

21、7可能通過(guò)同時(shí)阻斷MAPK(Erk1/2)和PI3K兩條通路的活化影響ES細(xì)胞的造血分化。    本研究中，RasN17可能通過(guò)以下機(jī)制下調(diào)EB細(xì)胞內(nèi)造血標(biāo)志的表達(dá)：第一，使ES細(xì)胞不能形成正常的EB，則造血分化缺乏合適的微環(huán)境而發(fā)生缺陷；第二，MAPK(Erk1/2)和Akt信號(hào)通路的抑制直接影響造血細(xì)胞的產(chǎn)生；第三，以上兩種機(jī)制同時(shí)存在。然而，RasN17抑制ES細(xì)胞造血分化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。 【參考文獻(xiàn)】 1Johnson L, Greenbaum D, Cichowski K, et al. K?ras is an essential g

22、ene in the mouse with partial functional overlap with N?ras. Genes Dev, 1997;11:2468-24812王曉燕，劉兵，毛寧. 小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的信號(hào)調(diào)控機(jī)制. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2006;14:1248-12523Paling NR, Wheadon H, Bone HK, et al. Regulation of embryo? nic stem cell self?renewal by phosphoinostide 3?kinase dependent signaling. J Biol Chem, 2

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