細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)考試重點(diǎn)

1、名詞解釋：1 .群體倍增時(shí)間：細(xì)胞指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞群倍增所需的時(shí)間。是由于表示群體細(xì)胞指數(shù)生 長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞分裂活動(dòng)的程度，是判斷細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的重要指標(biāo)。2 .接觸抑制(contact inhibition)：細(xì)胞相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。3 .密度抑制(density inhibition)：由于細(xì)胞密度過(guò)大，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)耗盡，代謝產(chǎn)物過(guò) 多和生存空間消失所引起的細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象。4 .腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells, TSC)表現(xiàn)為一種特殊類型的干細(xì)胞，具備高度增殖能力 與自我更新能力，也具備多向分化的潛能。TSC增殖過(guò)程中，通過(guò)不均一分裂，一個(gè)TSC分 裂形成一個(gè)新的TS

2、C和另一個(gè)可最終分化為包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的子細(xì)胞，其結(jié)果 是維持TSC數(shù)目穩(wěn)定并產(chǎn)生腫瘤。5 .細(xì)胞匯合(Confluent)：指細(xì)胞增殖生長(zhǎng)相互連接成片占據(jù)所有底物而積現(xiàn)象。6 .飽和密度(Saturation density)：在特殊培養(yǎng)條件下，每平方厘米(單層培養(yǎng))或每毫升細(xì) 胞懸液內(nèi)可達(dá)到的最大細(xì)胞數(shù)。7 .二倍體細(xì)胞系或株(Diploid cell line or strain)：具有二倍體染色體數(shù)的細(xì)胞系或株。8 .二倍體(Diploid)：指雙倍數(shù)的染色體數(shù)或具有此數(shù)的細(xì)胞系。9 .組織工程：是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原則及方法，在正確認(rèn)識(shí)正常及病理兩種狀態(tài)下的 組織結(jié)構(gòu)與

3、功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷 后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。10 .細(xì)胞融合(Cell fusion)：指兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞借媒介物(PEG等)融合成雜種細(xì)胞的過(guò)程。11 .細(xì)胞富集：當(dāng)細(xì)胞分離純化并不完全徹底，培養(yǎng)物中能達(dá)到以某種細(xì)胞為主(占絕大多 數(shù))的程度。12 .三維培養(yǎng)：把細(xì)胞懸液接種在一定立體形態(tài)的支架上，使細(xì)胞生長(zhǎng)在三維環(huán)境中的培養(yǎng) 方法。13 .平衡鹽溶液(balanced salt solution, BSS)：簡(jiǎn)稱鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生 量鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體。兼具緩沖和調(diào)停溶液的酸堿度、維持

4、滲透壓、同時(shí)供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分的作用-14 .生長(zhǎng)基質(zhì)(growth substratum)：培養(yǎng)器皿表而包被的一層能改善生長(zhǎng)表面的特性，促 進(jìn)細(xì)胞粘附和貼壁的物質(zhì)。15 .去分化(dedifferentiation)：指已成熟的細(xì)胞和組織倒退分化，返回原始幼稚的狀態(tài)。 16.消化液：在原代細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞傳代時(shí)，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯 四乙酸二鈉(EDTA),其次是一些特殊的組織細(xì)胞培養(yǎng)用的各型膠原酶。在原代細(xì)胞培養(yǎng)中, 使用消化液從組織塊中分離(散)出單個(gè)的細(xì)胞；在進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)，消化液使細(xì)胞脫離生 長(zhǎng)表而并離散成單個(gè)細(xì)胞。17 .消毒disinfecti

5、on殺死物體上病原微生物的方法。滅菌sterilization殺滅物體上所有微生物的方法,包括病原微生物和非病原微生物、 繁殖體和芽胞。18 .轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：指細(xì)胞發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的遺傳改變而引起恒定的表型改變的細(xì)胞系。19 .雜交瘤技術(shù)：又稱單克隆抗體制備技術(shù)，是指建立雜交瘤細(xì)胞系的技術(shù)，通常指B淋巴 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，即將骨微瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，以建立可以分泌單一性抗體的雜 交瘤細(xì)胞系的技術(shù)。20 .指由一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的，只識(shí)別一種抗原決定簇的均質(zhì)抗體。21 .干細(xì)胞：是指具有無(wú)限或較長(zhǎng)期的自我更新能力、多種分化潛能和高度增殖能力的細(xì)胞。22 .全能干細(xì)胞，如ES細(xì)胞。全能干細(xì)胞可

6、以分化成人體的各種細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成人體的 各種組織和器官。23 .成體干細(xì)胞：在胎兒、兒童和成人組織中存在的具有自我更新、多向分化潛能和增殖特 性的多能干細(xì)胞，統(tǒng)稱為“成體干細(xì)胞”。24 .融合劑：兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合過(guò)程中，能促使細(xì)胞融合并使細(xì)胞融合的頻率顯著 增大的物質(zhì)，如仙臺(tái)病毒，PEG等。25 .克隆化：專指一般DNA在與載體DXA分子重組后，重組DXA分子由載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)， 依賴載體的復(fù)制能力在宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成一個(gè)無(wú)性繁殖系的過(guò)程。26 .細(xì)菌污染：包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物（真 菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)

7、胞被細(xì)菌污染均會(huì)造成細(xì)胞受損和 死亡，是細(xì)胞培養(yǎng)工作的大敵。細(xì)胞發(fā)生污染時(shí)，常有培養(yǎng)液變渾濁和PH發(fā)生改變等現(xiàn)象, 鏡下觀察細(xì)胞變形、生長(zhǎng)緩慢或分裂相消失，以及細(xì)胞圓縮脫落等現(xiàn)象。常有抗生素預(yù)防該 污染。27 . iPS:誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞即誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，是指體細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因“重新編 排”，回歸到胚胎細(xì)胞的狀態(tài)，從而具有類似胚胎干細(xì)胞的分化能力。這種方法 可以不需要用人胚胎或卵母細(xì)胞，就能制造干細(xì)胞。28 .克?。褐竿ㄟ^(guò)一定方法獲得由單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖形成的細(xì)胞集落。 簡(jiǎn)答題：1 .簡(jiǎn)述細(xì)胞培養(yǎng)污染的種類及污染的預(yù)防措施種類：（1）物理污染：溫度、放射線、震動(dòng)、輻射等；（2）化學(xué)污染：水、血清、容

8、器、孵箱等的有毒物質(zhì)的殘留；（3）生物污染（支原體污染）：外界的動(dòng)物、微生物如霉菌、細(xì)菌、支原體和其它類 型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染。預(yù)防措施：（1）良好的規(guī)章制度：只有相關(guān)人員才可進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)必須和 其他區(qū)域分開(kāi)，細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)應(yīng)布局合理；（2）良好的無(wú)菌操作：所有玻璃器皿和培養(yǎng)液與試劑的配制應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌，吸入 或吸出液體時(shí)避免傾倒，不要觸碰細(xì)胞培養(yǎng)瓶的瓶口，清潔區(qū)和污染區(qū)的 材料應(yīng)單獨(dú)處理；（3）保持工作區(qū)清潔：常規(guī)清洗地而和臺(tái)面，定期清潔水浴箱、C02孵箱、生 物安全柜等，及時(shí)清理廢棄物；（4）合理利用抗生素（5）建立細(xì)胞庫(kù)：消除了隱蔽污染的潛在危害（6）細(xì)胞污染的檢測(cè)2

9、 .試述細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念、原理、優(yōu)缺點(diǎn)及實(shí)際意義1）概念：細(xì)胞（組織）培養(yǎng)是指從生物體內(nèi)取出細(xì)胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú) 菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。2）原理及優(yōu)缺點(diǎn):細(xì)胞培養(yǎng)是將確定所選組織用剪碎的小組織塊或分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)，這種培養(yǎng)失去了原有組織類型及某些生化特征，但它們可以增殖，特性化，獲得遺傳 背景相同的群體，可以保存。3）實(shí)際意義：組織（細(xì)胞）培養(yǎng)對(duì)醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)的意義培養(yǎng)的組織器官或細(xì)胞，能再一定范圍和程度上反映生命活動(dòng)規(guī)律和機(jī)體功能特點(diǎn)。 培養(yǎng)的細(xì)胞為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)各種研窕奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。如藥物篩選，療劑評(píng)價(jià)， 新生

10、物制品研發(fā)，研究病毒及其他微生物，發(fā)現(xiàn)新的傳染因子，組織工程中的支撐技術(shù)等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為商品化生物技術(shù)產(chǎn)品的核心。如目前可提供的產(chǎn)品，病毒疫苗： 口蹄疫、狂犬疫苗和乙肝疫苗等：非抗體型免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白介素和集落 刺激因子等：多肽生長(zhǎng)因子：表皮生長(zhǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子等：酶類：組織型纖 溶酶原激活劑；激素：EPO和促黃體生成素等：殺蟲劑：桿狀病毒；腫瘤特異抗 原：癌胚抗原：通過(guò)雜交瘤生產(chǎn)的各種單克隆抗體：細(xì)胞本身（如干細(xì)胞）；皮 膚重植等。4）組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的局限性：細(xì)胞（組織）培養(yǎng)，包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少 生物整體的嚴(yán)密聯(lián)系，不能代表整個(gè)機(jī)體。在進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)過(guò)程及對(duì)

11、結(jié)果的 評(píng)估都必須考慮這些。3 .簡(jiǎn)述細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如何進(jìn)行微生物污染防治1）把好每一個(gè)關(guān)口，盡可能禁止任何有污染的物品進(jìn)入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)；2）抗生素：一般用常用量的510倍作沖擊療法。用藥2448h后，再換常規(guī)培養(yǎng)液。3）加溫處理：根據(jù)支原體對(duì)熱敏感的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞放置在41c作用 510h,最長(zhǎng)不超過(guò)18h后，以殺滅支原體。4）動(dòng)物體內(nèi)接種：將支原體污染的細(xì)胞接種在同種動(dòng)物的皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)的免 疫系統(tǒng)消滅支原體。待一定時(shí)間后取出細(xì)胞，做原代培養(yǎng)再進(jìn)行繁殖。4 .試述目前體外細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛使用最多的天然培養(yǎng)基類型及其作用天然培養(yǎng)基（液）的種類很多，包括生物性體液（如血清、血

12、漿）、組織浸液（胚胎浸液）、 水解乳蛋白等。1）血清：血清中含有基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)血清中含有激素與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子血清中含有促進(jìn)細(xì)胞粘附和鋪展的因子血清中含有結(jié)合蛋白血清中含有抗機(jī)械損害的非特異性保護(hù)物質(zhì)血清中含有pH緩沖物質(zhì)血清中含有蛋白酶抑制劑2）胚胎浸出液（embryonic extract）是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，如雞 胚浸出液、牛胚浸出液等。胚胎浸出液主要成分為大分子蛋白和小分子氨基酸, 有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。3 ）水解乳蛋白（lactalbumin hydrolysate）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶水解的產(chǎn)物，含有富 的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細(xì)胞系和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。5

13、 .血清的優(yōu)缺點(diǎn)：1）優(yōu)點(diǎn)：血清中含有基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)血清中含有激素與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子血清中含有促進(jìn)細(xì)胞粘附和鋪展的因子血清中含有結(jié)合蛋白血清中含有抗機(jī)械損害的非特異性保護(hù)物質(zhì)血清中含有pH緩沖物質(zhì)血清中含有蛋白酶抑制劑2）缺點(diǎn)：血清中也存在不少有害于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)血清的成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析對(duì)多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)講，血清并不是細(xì)胞在體時(shí)直接接觸的生理性液體，只有在傷口愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種 細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。血清也具有潛在的細(xì)胞毒作用，除了特異性抑制成分、細(xì)菌毒素以及脂類成 分之外，還含有多胺氧化酶等。不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得

14、培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。需 要分批篩選，而且永遠(yuǎn)不可能保持批次間的一致；在培養(yǎng)液中使用血清會(huì)增加成本，尤其是對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及使 用胎牛血清培養(yǎng)的情況更如此；血清中有時(shí)所含的生長(zhǎng)因子水平不足而需要補(bǔ)充，若補(bǔ)充過(guò)量會(huì)抑制細(xì)胞生 長(zhǎng)。培養(yǎng)批次與血清批次不同，生長(zhǎng)因子水平是難以控制的。6 .簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的主要生物學(xué)特點(diǎn)去分化：貼壁鋪陳：接觸抑制：密度依賴性生長(zhǎng)抑制7 .體外培養(yǎng)用液的種類及用途主要包括：培養(yǎng)液（維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)最重要的條 件。）、緩沖液（中和培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì)）、平衡鹽溶液（配抗生素、消化液、洗滌細(xì)胞 等）、消化液（分離細(xì)胞）、血清、pH調(diào)整液

15、和抗生素等其它常用液。8 .比較天然和合成培養(yǎng)基的優(yōu)缺點(diǎn)1）天然培養(yǎng)基：最初的體外細(xì)胞培養(yǎng)，均采用天然培養(yǎng)基。其主要取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物 組織中分離提取。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)豐富，培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，來(lái)源受限，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體染。2）合成培養(yǎng)基：細(xì)胞在體內(nèi)生存生長(zhǎng)所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。9 .試述細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本要求主要包括細(xì)胞接種、培養(yǎng)液成分、酸堿度、氣體條件、溫度、水 的純度及無(wú)菌條件。1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞密度選擇對(duì)數(shù)期

16、的細(xì)胞接種。2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：天然培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜，包括血清、組織浸出液、淋巴液、水解乳 蛋白等：合成培養(yǎng)基：包括水、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、維生素、氨基酸等：3）酸堿度：細(xì)胞能耐受的pH范圍是6. 6-7.8,最是的pH為7. 2-7. 4,要依靠緩沖系統(tǒng)調(diào) 節(jié)，主要是CONaHCO,系統(tǒng)。4）氣體：細(xì)胞生長(zhǎng)需要，主要用于調(diào)行細(xì)胞培養(yǎng)的pH,同時(shí)也用于合成細(xì)胞物質(zhì)。5）溫度：最適宜生長(zhǎng)的溫度為3537C：6）水：一般使用的是去離子水或三蒸水，適宜細(xì)胞培養(yǎng)：7）抗生素：加入兩性霸素可控制微生物的生長(zhǎng)。10 .體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的三個(gè)顯著特征：永生性、不受控增殖性、致瘤性。（轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的特征）1）永生性也

17、稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤 細(xì)胞系（株）都表現(xiàn)有這種性狀。2）細(xì)胞接種同種動(dòng)物或裸鼠后的致瘤性是客觀反映細(xì)胞惡性程度的指標(biāo)。3）失去接觸抑制，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。失去錨著依賴性（停泊依賴性），可在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長(zhǎng)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落的能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。11 .簡(jiǎn)述原代腫瘤細(xì)胞制備過(guò)程及其注意事項(xiàng)及如何建成永久性細(xì)胞系癌細(xì)胞建系的方法和程序相似于正常細(xì)胞，包括標(biāo)本收集和處理、原代培養(yǎng)、傳代、換液、 凍存、復(fù)蘇等過(guò)程。1）取材：取材部位非常重要，要挑選活力較好的部位，一般是癌組織最外層最

18、活躍細(xì)胞。 注意去除標(biāo)本中混雜的間質(zhì)組織。2）分離：機(jī)械方法、酶消化法，其中酶消化法是分散癌細(xì)胞的好方法。3）接種細(xì)胞：消化后制餡的癌細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)有足夠的細(xì)胞密度，通常接種細(xì)胞濃度為 5X105/ml, 37培養(yǎng)。4）成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的去除：常采用機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法等。5）選擇性培養(yǎng)基：選擇性培養(yǎng)基是針對(duì)特殊細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求設(shè)計(jì)的。在癌細(xì)胞建系中， 選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用是提高癌細(xì)胞體外存活、抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵技術(shù)改進(jìn)。6）飼養(yǎng)層：在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細(xì) 胞生長(zhǎng)和抑制癌組織中正常成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。7）及時(shí)換液癌細(xì)胞系建立注意事項(xiàng)：取材

19、應(yīng)選擇活力較好的部位，盡快培養(yǎng)且要防止污染。及時(shí)去除 生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞。掌握好傳代時(shí)間，細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)到足夠量時(shí)不要急于傳代。早期應(yīng)先 以高濃度接種，再逐漸降低。對(duì)于增殖能力低的細(xì)胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入一 些促生長(zhǎng)物質(zhì)。精心傳代、換液、避免污染，需經(jīng)半年以上的細(xì)胞培養(yǎng)，方能夠達(dá)到建 立細(xì)胞系的目的。如何建成永久性細(xì)胞系：建立癌細(xì)胞系需要在體外進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)和傳代，傳代50次以上 才能被認(rèn)為是永久性細(xì)胞系。建系過(guò)程需要不斷凍存以防細(xì)胞系中斷。12 .雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的三個(gè)技術(shù)基礎(chǔ)（關(guān)鍵）：1） B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞（B lymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌 針對(duì)該抗原的

20、特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。本身是一種終末分化細(xì)胞，通 常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡一一短命細(xì)胞。竹臃瘤細(xì)胞（myeloma cells）：惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活一一長(zhǎng)命細(xì)胞,沒(méi) 有抗體分泌。經(jīng)篩選HGPRT -或TK -。2）細(xì)胞融合技術(shù)：分泌抗體短命脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）、長(zhǎng)命不分泌抗體骨筋瘤細(xì)胞、分 泌抗體長(zhǎng)命雜交瘤細(xì)胞。3）雜交瘤細(xì)胞的篩選：用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，只有雜交瘤細(xì)胞被篩選出。13 .試述雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體三個(gè)基本環(huán)節(jié)和兩個(gè)決定因素三個(gè)基本環(huán)節(jié)1）漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系,骨髓瘤細(xì)胞NS1或SP2/0,需通過(guò)8-氮鳥噂吟選

21、擇出來(lái)，有利于HAT 選擇培養(yǎng)基篩選。而且NS1或SP2/0必須是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度控制在IO,/ml,細(xì)胞 活力達(dá)95%,進(jìn)行細(xì)胞融合時(shí)1. 5*10,細(xì)胞數(shù)。2）免疫鼠脾細(xì)胞良好、合適，大多數(shù)情況下，并不需要高度免疫：3）融合劑良好合適，50%PEGo兩個(gè)決定因素1）選擇培養(yǎng)基（HAT） 2）飼養(yǎng)細(xì)胞以上）：來(lái)自同系小鼠的胸腺細(xì)胞或腹腔巨 噬細(xì)胞14 .與胚胎干細(xì)胞相比較，成體干細(xì)胞有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）成體干細(xì)胞體枳小，細(xì)胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過(guò)程中處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，在 組織結(jié)構(gòu)中位置相對(duì)固定。（2）成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

22、（3）成體干細(xì)胞常處于一個(gè)有干細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)、對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化起調(diào)控作用的各種信 號(hào)分子的特定微環(huán)境或稱生物位中，干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化為功能細(xì)胞，取決于所在 的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。（4）成體干細(xì)胞沒(méi)有確定的來(lái)源。15 .干細(xì)胞研究的意義干細(xì)胞在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域都有著重要而深遠(yuǎn)的影響，如移植治療、克隆動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物的生產(chǎn)、細(xì)胞組織和器官的修復(fù)、組織工程等有著廣闊的應(yīng)用前景。1）移植治療：移植治療目前已成為治療疾病的一個(gè)重要手段，如器官移植、細(xì)胞移植等。 2）克隆動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)：利用這項(xiàng)技術(shù)人們還可以將一些在發(fā)育過(guò)程中非必需 的基因敲除（knock out）,在體內(nèi)進(jìn)行功能

23、缺失研窕；還可以通過(guò)基因功能獲得性突變， 使特定基因在發(fā)育的某一時(shí)期表達(dá)，從而研究該基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期中的作用。3）轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞基因治療：現(xiàn)有的基因治療有兩類：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞治療核酸治療。4）為發(fā)育生物學(xué)研究提供理想的體外模型：胚胎干細(xì)胞提供了在細(xì)胞和分子水平上研究 個(gè)體發(fā)育過(guò)程中極早期事件的良好材料和方法。5）高效新型藥物的發(fā)現(xiàn)、篩選及動(dòng)物和人類疾病的模型：胚胎干細(xì)胞提供了新藥物的藥 理藥效、毒理及藥物代謝等研究的細(xì)胞水平的研究手段。利用胚胎干細(xì)胞體外分化的細(xì)胞 組織檢驗(yàn)篩選新藥，可大大減少藥物實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量及其人群數(shù)量。總之，干細(xì)胞研究對(duì)細(xì)胞組織移植治療，體外研究動(dòng)物、人胚胎的發(fā)生

24、、發(fā)展，新的人類 因發(fā)現(xiàn)，藥物的篩選和致畸實(shí)驗(yàn)及克隆動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生重要的影響。16 .試述進(jìn)行成體干細(xì)胞研究有哪些優(yōu)勢(shì)1）成體干細(xì)胞則可從患者自身獲得，而不存在組織相容性的問(wèn)題，治療時(shí)可避免長(zhǎng)期應(yīng)用 免疫抑制劑對(duì)患者的傷害。此外，少量的骨髓切除治療有助于形成部分造血嵌合體，可使 異體成體干細(xì)胞的治療成為可能。2）成體干細(xì)胞不會(huì)引發(fā)畸胎瘤。3）成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的高度分化能力。在人體發(fā)育的過(guò)程中，可能成體干細(xì) 胞是存留在多種組織中具有多系分化能力的亞全能干細(xì)胞群體，這些細(xì)胞都具有相同或相 似的細(xì)胞表型，在適合的微環(huán)境下可分化成多種組織細(xì)胞。17 .試述癌細(xì)胞系鑒定要點(diǎn)（簡(jiǎn)

25、述體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，需要做一系列的細(xì)胞 生物學(xué)測(cè)定，主要的目的在于：證明所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來(lái)源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞, 而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。1）形態(tài)觀察：主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、 多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。2）細(xì)胞生長(zhǎng)增殖：檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間。3）細(xì)胞核型分析：檢測(cè)核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無(wú)、帶型等。4）軟瓊脂培養(yǎng)：檢測(cè)集落形成能力。5）異體動(dòng)物接種：向異體動(dòng)物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。6）其它：

26、根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等。18 .簡(jiǎn)述細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程及各期細(xì)胞的特點(diǎn)1）原代培養(yǎng)期：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 組織到第一次傳代時(shí)間大約為14周。特點(diǎn)：培養(yǎng)細(xì)胞成分混雜，呈現(xiàn)異質(zhì)性。細(xì) 胞活躍移動(dòng)，分裂，但不旺盛，多呈二倍體核型。原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng) 基本相似，適宜進(jìn)行疫苗制備、藥物測(cè)試、移植等。為保持二倍體體細(xì)胞性質(zhì)，應(yīng)在初代 或傳代后早期冰凍。2）傳代培養(yǎng)期：首次傳代開(kāi)始經(jīng)反復(fù)傳代一直到培養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始衰退之前的全部時(shí)間。初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系（cell line）。特點(diǎn)：細(xì)胞增殖旺盛，并維

27、持二 倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系（diploid cell line） 一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。細(xì)胞 逐漸進(jìn)入去分化狀態(tài)。原本成分混雜的培養(yǎng)物中，某一種增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)逐漸處 于優(yōu)勢(shì)，比例越來(lái)越大,而將其它數(shù)量較少比例較小的細(xì)胞逐漸淘汰掉。3）衰退期：細(xì)胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。輪廓增強(qiáng)，色澤變暗， 胞質(zhì)出現(xiàn)顆粒樣及空泡狀結(jié)構(gòu)°在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在不明原因的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。標(biāo)志之一， 是細(xì)胞獲得不死性即持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱“無(wú)限細(xì)胞系”。核型大多變成異 倍體，接觸抑制消失。19 .干細(xì)胞研究的主要內(nèi)容與問(wèn)題1 .主要內(nèi)容1

28、）干細(xì)胞的分離與鑒定2）干細(xì)胞的自我更新3）干細(xì)胞的定向分化4）干細(xì)胞的臨床應(yīng)用2 .問(wèn)題1）胚胎干細(xì)胞建系及定向誘導(dǎo)成組織細(xì)胞的分子機(jī)制；2）成體干細(xì)胞橫向分化的條件；3）各種組織的成體干細(xì)胞庫(kù)的建立及臨床治療試驗(yàn)：4）細(xì)胞移植的免疫排斥問(wèn)題。20 .粘附生長(zhǎng)型細(xì)胞根據(jù)形態(tài)分為幾種類型，試述各型主要特點(diǎn)。1）粘附型細(xì)胞 Monolayer cells）:附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。a成纖維細(xì)胞型：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體極形或不規(guī)則，三角形，胞質(zhì) 向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不等的片狀偽足，中有卵圓形核。生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，液 渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞一細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)

29、行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì) 胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起。b上皮細(xì)胞型：形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平、不規(guī)則多角形，中有圓形核。生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠一緊密相連一成薄層一鋪路石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很 少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)。c游走型細(xì)胞：培養(yǎng)需要支持物，分散生長(zhǎng)，不連接成片，在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)位置不定，處 于活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，因此外形不規(guī)則且不斷變化，密度大連接成片呈多角形不易 與其他類型的細(xì)胞區(qū)別。d多型性細(xì)胞：無(wú)規(guī)律的形態(tài)，細(xì)胞分胞體和胞突。胞突細(xì)長(zhǎng)形，似絲狀偽足，胞體略呈多 角形。21 .試述“克隆”的基本概念并舉例說(shuō)明其在細(xì)胞培養(yǎng)工作中的實(shí)際意義。1）克隆：指通過(guò)一定方法獲得由單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖形成的細(xì)胞集落。2）實(shí)際意義:a檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑：?jiǎn)慰寺】贵w以其特異性強(qiáng)、純度高、均一性好等優(yōu)點(diǎn)，廣