水產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)

1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文水產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)姓名：王宏萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：鮑依稀;周曉明20090501水產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)摘要副溶血性弧菌是食物中毒的重要病原菌。環(huán)境中的副溶血性弧菌為非致病菌，為致病菌。判斷水產(chǎn)品的食用合格性需要準(zhǔn)確鑒定的致病菌。神奈川溶血反應(yīng)曾作為致病性判定的標(biāo)準(zhǔn)，但該試驗(yàn)操作繁瑣，易產(chǎn)生假陽(yáng)性。耐熱性溶血毒素作為副溶血性弧菌致病性的主要毒力因子，可由基因的檢出來(lái)判斷菌株的致病性。該方法尚未在國(guó)內(nèi)進(jìn)行應(yīng)用。本研究建立了一個(gè)以序列分析鑒定副溶血性弧菌，以基因測(cè)定的和實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系定量反映副溶血性弧菌致病性的方法，并

2、與神奈川溶血反應(yīng)，脲酶反應(yīng)進(jìn)行比較。使用分析臨床分離的株常見(jiàn)菌作為對(duì)照，對(duì)株副溶血性弧菌進(jìn)行測(cè)定；株副溶血性弧菌的鑒定結(jié)果與生化培養(yǎng)法相符，對(duì)臨床分離菌株均無(wú)誤判。對(duì)株腹瀉患者來(lái)源和株環(huán)境來(lái)源分離的副溶血性弧菌進(jìn)行基因測(cè)定，神奈川溶血反應(yīng)和脲酶反應(yīng)。腹瀉患者和環(huán)境來(lái)源菌株的基因檢出率有顯著差異（，）。神奈川溶血反應(yīng)和脲酶反應(yīng)的區(qū)分能力低于基因檢測(cè)。建立了一個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)以測(cè)定基因拷貝水平，定量公式為（，）。關(guān)鍵詞：副溶血生弧菌，序列分析，基因，實(shí)時(shí)熒定量，神奈川溶血反應(yīng)資助渠道：本課題受上海市科委技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng)資助以及上海申康醫(yī)院發(fā)展中心病原體檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)資助，口廠口辦口”紗紀(jì)“（），重慶醫(yī)

3、科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文，（）（，滬）：，重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文英文縮寫(xiě)沖符號(hào)說(shuō)明英文全稱中文全稱核糖體核糖體堿性蛋白胨水改良的培養(yǎng)基腹瀉性貝毒中毒翅甲藻毒素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)神奈川現(xiàn)象長(zhǎng)距離精確培養(yǎng)基磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)時(shí)熒光定量反向膠乳凝集試驗(yàn)社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽汁酸鹽蔗糖瓊脂耐熱性溶血毒素不耐熱溶血毒素耐熱性溶血毒素相關(guān)溶血毒素副溶血性弧菌重慶醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得重慶醫(yī)科

4、大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料，與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意，申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任學(xué)位論文作者簽名：每避二期：號(hào)乏嗥一學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解重慶醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，?。貉芯可诠プx學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬重慶醫(yī)科大學(xué)本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果對(duì)署名單位為重慶醫(yī)科大學(xué)，學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全都或部分內(nèi)容（保密內(nèi)容除外），可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名：絲益

5、指導(dǎo)教師簽名：日期：重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文水產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)前言水產(chǎn)品是人類生活重要的食物來(lái)源之一。本文所指的水產(chǎn)品主要包括魚(yú)，貝類，甲殼類等動(dòng)物性水產(chǎn)品。我國(guó)每年經(jīng)上?？诎哆M(jìn)出口的水產(chǎn)品約萬(wàn)噸，總值約億美元，全國(guó)每年水產(chǎn)品消費(fèi)額超過(guò)億元人民幣【。水產(chǎn)品的主要衛(wèi)生問(wèn)題是細(xì)菌污染和細(xì)菌毒素殘留導(dǎo)致的食用者胃腸炎或食物中毒。我國(guó)細(xì)菌性食物中毒的首要病原菌為副溶血性弧菌（，）。在上海，副溶血性弧菌在細(xì)菌性食物中毒事件中的分離率為【，。副溶血性弧菌也是引起日本，美國(guó)，歐洲以及東南亞等沿海國(guó)家和地區(qū)食源性疾病的常見(jiàn)病原茵。我國(guó)曾經(jīng)強(qiáng)制要求將副溶血性弧菌的檢測(cè)作為水產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

6、（，）。國(guó)際微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)和日本，英國(guó)，加拿大等國(guó)及我國(guó)香港地區(qū)都提出對(duì)水產(chǎn)品開(kāi)展副溶血性弧茵的檢測(cè)工作。副溶血性弧菌廣泛生存于近海岸的海水，海底沉積物和魚(yú)蝦類，貝類及鹽漬加工的水產(chǎn)品中。我國(guó)華東沿海水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢出率為，夏季高達(dá)【】。腌制魚(yú)貝類的帶菌率達(dá)（：）。根據(jù)致病性可將副溶血性弧菌分為致病菌和非致病菌。然而，自然環(huán)境和水產(chǎn)品中分離得到的大多數(shù)副溶血性弧菌都無(wú)致病性，為致病菌【】。這個(gè)比例可因季節(jié)，地理位置或樣本類型的不同而有所浮動(dòng)。所以，副溶血性弧茵的檢出與水產(chǎn)品是否可以安全使用并不完全相符。僅根據(jù)副溶血性弧菌的檢出作為水產(chǎn)品安全的控制標(biāo)準(zhǔn)，將無(wú)法進(jìn)行水產(chǎn)品的正常進(jìn)出口貿(mào)易

7、。關(guān)鍵是要準(zhǔn)確鑒定出致病性副溶血性弧菌，對(duì)于有效控制我國(guó)口岸水產(chǎn)品質(zhì)量，保障社會(huì)消費(fèi)水產(chǎn)品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)是項(xiàng)重要工作。傳統(tǒng)的分離鑒定細(xì)菌的方法主要是生化表型鑒定法。這種方法耗時(shí)較長(zhǎng)（天）【】，由于細(xì)菌的生化代謝型經(jīng)常隨環(huán)境條件的差異而有很大差異，因此，很多細(xì)重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文菌種類可能難以鑒定。核糖體（）是細(xì)菌分型鑒定可用的標(biāo)志物之一，常使用基因序列的差異進(jìn)行分型。是細(xì)菌染色體上編碼相對(duì)應(yīng)的序列，該基因序列全長(zhǎng)約，由可變區(qū)和保守區(qū)交替組成，包含一定的種間多態(tài)性網(wǎng)。能通過(guò)測(cè)序技術(shù)快速得到核酸序列，是理想的基因鑒定靶序列。此外，大腸埃希茵，志賀氏茵，葡萄球菌，普通變形桿菌等也是食源性傳播可

8、引起腹瀉或食物中毒的細(xì)菌，其腹瀉患者的炎癥反應(yīng)與副溶血性弧菌感染菌者相似。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌需要與這些混雜細(xì)菌區(qū)分開(kāi)。大多數(shù)臨床來(lái)源和少數(shù)環(huán)境或水產(chǎn)品來(lái)源的副溶血性弧菌在我萋培養(yǎng)基（）上培養(yǎng)、時(shí)后菌落周?chē)沙尸F(xiàn)出清晰透明的一溶血環(huán)，稱為神奈川現(xiàn)象（，）。曾使用神奈川溶血反應(yīng)將副溶血性弧菌分為致病性和非致病性菌株。但是神奈川反應(yīng)操作繁瑣，在多種實(shí)踐環(huán)境中反應(yīng)不典型，不易判斷結(jié)果【】，不適合口岸檢疫或臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的需求。神奈川現(xiàn)象可由耐熱性溶血毒素（，）弓起【，因此認(rèn)為是副溶血性弧菌主要的毒力因子。一些研究發(fā)現(xiàn)有的致病性副溶血性弧茵為陰性，但這些菌株中可檢測(cè)到耐熱性溶血毒素

9、相關(guān)溶血毒素（，）】，認(rèn)為是副溶血性弧菌的又一致病因子。和分別由和砌編碼【】，但是砌基因的檢出率（）【，遠(yuǎn)小于基因（）【，】，因此，基因可能比砌基因更適宜作為判斷致病性副溶血性弧菌的標(biāo)志物。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（），免疫層析試驗(yàn)（）等免疫學(xué)方法已經(jīng)用于副溶血性弧菌表達(dá)水平的檢測(cè)，最低檢出限分別為和。但是這些方法無(wú)法檢測(cè)出環(huán)境或臨床分離的因環(huán)境，代謝改變而暫無(wú)表達(dá)或表達(dá)量較低的致病性副溶血性弧菌【臨引。雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（）可以檢測(cè)砌基因，可用于區(qū)分致病性和非致病性副溶血性弧菌。但是不能測(cè)定基因的拷貝水平，難于對(duì)致病性進(jìn)行定量分析。因此，我們希望建立一個(gè)以定量基因拷貝水平的實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系以定量

10、反映副溶血性弧菌的致病能力。綜上所述，本研究希望建立一個(gè)序列分析方法用于副溶血性弧菌重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文菌株的準(zhǔn)確鑒定：建立針對(duì)副溶血性弧菌致病因子的快速基因檢測(cè)和定量檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)該方法與神奈川反應(yīng)，脲酶反應(yīng)的應(yīng)用效果。以此數(shù)據(jù)為依據(jù)，應(yīng)用于水產(chǎn)品安全性的常規(guī)檢疫過(guò)程。重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)材料和方法材料菌株來(lái)源副溶血性弧茵：年月至年月之間分別從上海市金山區(qū)，浦東新區(qū)和舟山漁場(chǎng)的食物中毒和胃腸炎腹瀉患者，水產(chǎn)品及陸地環(huán)境水，養(yǎng)殖用水樣本中分離得到，由上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局提供（表）。表副溶血性弧茵茵株來(lái)源將腹瀉患者分離的副溶血性弧菌視為臨床來(lái)源菌株，水產(chǎn)品和水樣分離的菌

11、株視為環(huán)境來(lái)源菌株。臨床分離菌株：年月至年月之間從上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室分離的臨床常見(jiàn)菌株，經(jīng)生化培養(yǎng)法鑒定為種共株（表）。重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文表臨床分離生化培養(yǎng)鑒定茵株材料和試劑羊血瓊脂平板（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司）硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽汁酸鹽蔗糖瓊脂粉（）（上海市疾病預(yù)防控制中心試劑研究中心提供）液體培養(yǎng)基（公司）血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（上海市疾病預(yù)防控制中心試劑研究中心提供）尿素瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（上海市疾病預(yù)防控制中心試劑研究中心提供）鑒定條（法國(guó)生物梅里埃公司），鑒定卡（法國(guó)生物梅里埃公司）柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），緩沖液（含），

12、酶（，寶生物工程有限公司，大連）重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文引物合成（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）柱式膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），緩沖液（含），熱啟動(dòng)酶（，寶生物工程有限公司，大連）探針合成（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）新鮮兔血（上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局食品與動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫中心提供）儀器藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）小型全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）血細(xì)胞計(jì)數(shù)板相差顯微鏡：（尼康公司）型落地式恒溫?fù)u床（公司）紫外分光儀（公司）儀：（公司）實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x：（公司）方法細(xì)菌復(fù)蘇或培養(yǎng)鑒定取副溶血性弧茵的保存菌株在硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽汁酸鹽一蔗糖瓊脂

13、（，）平板劃線，培養(yǎng)小時(shí)。臨床分離菌株菌株經(jīng)平板劃線，培養(yǎng)小時(shí)后，革蘭氏染色，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)和顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)；使用鑒定條或，鑒定卡（藥敏分析系統(tǒng)和小型全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，法國(guó)生物梅里埃公司）確定菌株的生化培養(yǎng)型。副溶血性弧菌值的測(cè)定和相差顯微鏡下絕對(duì)計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇株不同的副溶血性弧菌在平板上形成的菌落，挑取適量，重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文接種于液體培養(yǎng)基。震蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以空白液調(diào)零，測(cè)定茵液值。茵液經(jīng)適度稀釋，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在相差顯微鏡下進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)。神奈川溶血試驗(yàn)將副溶血性弧菌株接種于含的血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)小時(shí)，小時(shí)內(nèi)觀察結(jié)果。菌落周?chē)尸F(xiàn)出清晰透明溶血環(huán)為陽(yáng)

14、性結(jié)果，無(wú)溶血或非溶血為陰性結(jié)果。脲酶試驗(yàn)將副溶血性弧茵接種于含的尿素瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)小時(shí)，觀察結(jié)果。細(xì)菌基因組的定量提取從平板或血平板挑取適量菌落或?qū)⒁褱y(cè)定值的菌液離心取沉淀物，混于溶液（，），使用柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）依照操作說(shuō)明提取細(xì)菌基因組。簡(jiǎn)述為依次加入裂解液和蛋白酶溶液，裂解細(xì)菌釋放基因組，離心，取上清液加入。吸附柱，使用洗滌液去除雜質(zhì)，用洗脫，獲得細(xì)菌基因組，濃度約為。引物和探針設(shè)計(jì)和砌基因的普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（）擴(kuò)增引物分別根據(jù)文獻(xiàn)【，合成。的引物正向序列為：，（參考序列：，位置在處）【】，反向序列為：（位置在處）】?；虻奈恢靡罁?jù)號(hào)為

15、的基因序列，正向引物為一（位置在處），反向引物為（位置在處）】。砌保守序列來(lái)源于條己報(bào)道的序列的序列（序列號(hào)分別為，￥，￥，￥和），根據(jù)保守區(qū)域毆計(jì)探針，序列為重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文（位置在處）。因上述擴(kuò)增基因的引物與探針組合不能有效進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，因此使用軟件另行設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量適用的擴(kuò)增引物，正向序列為一（位置在處），反向序列為（位置在。處），目的片段長(zhǎng)度為。和基因擴(kuò)增序列的擴(kuò)增條件為反應(yīng)體系，細(xì)菌基因組做模板，“正反向引物各，×緩沖液（含），酶（，寶生物工程有限公司，大連），補(bǔ)足體系。擴(kuò)增條件為起始變性分鐘；接著反應(yīng)個(gè)循環(huán)（秒；秒；（分鐘）；終末延伸分鐘。以做空白

16、對(duì)照。產(chǎn)物取作瓊脂糖凝膠電泳（，分鐘）。基因的擴(kuò)增使用的擴(kuò)增引物為：正向引物，反向引物【。條件為“反應(yīng)體系，模板使用細(xì)菌基因組，正反向引物各，山緩沖液（含），“酶（，寶生物工程有限公司，大連），補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件為起始變性分鐘；之后反應(yīng)個(gè)循環(huán)（秒；秒；分鐘）；終末延伸分鐘。以做空白對(duì)照。產(chǎn)物取作瓊脂糖凝膠電泳（，分鐘）。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序（測(cè)序試劑為，測(cè)序引物使用正向擴(kuò)增引物。測(cè)序結(jié)果用校正后，在網(wǎng)站上（¨）進(jìn)行比對(duì)。判斷標(biāo)準(zhǔn)重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文結(jié)果中出現(xiàn)比對(duì)分值最高（具有數(shù)值）的細(xì)菌種類的比對(duì)結(jié)果確定為相應(yīng)屬種。定量基因標(biāo)準(zhǔn)模板的制

17、備使用柱式膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）依據(jù)說(shuō)明書(shū)將電泳分離的基因擴(kuò)增片段從瓊脂糖凝膠中回收。用以拷貝為量級(jí)從依次稀釋至。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)使用的擴(kuò)增引物為：正向序列，反向序列。反應(yīng)體系檢測(cè)了株經(jīng)普通篩出的副溶血性弧茵。模板，分別為砌基因標(biāo)準(zhǔn)模板（）和待測(cè)的副溶血性弧茵基因組。基因標(biāo)準(zhǔn)模板各拷貝梯度均平行個(gè)復(fù)管作為定量基準(zhǔn)，州正反向基因熒光定量引物各，探針，山緩沖液（含），熱啟動(dòng)酶（，寶生物工程有限公司，大連），補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件為開(kāi)始一個(gè)循環(huán)預(yù)變性分秒，接著個(gè)循環(huán)（秒；秒），采集熒光。熒光采集通道為，。作為空白對(duì)照。統(tǒng)計(jì)分析使用整理數(shù)據(jù)并繪制細(xì)菌值與菌液絕對(duì)計(jì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

18、兩組數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗(yàn)（，統(tǒng)計(jì)計(jì)算使用軟件（美國(guó)）；指數(shù)計(jì)算方法為“靈敏度特異度”。重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果副溶血性弧菌的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的副溶血性弧菌株值在之間，相應(yīng)的顯微鏡下菌液的絕對(duì)計(jì)數(shù)值為個(gè)。兩者的線性關(guān)系為（，）（圖）。按此計(jì)算式可根據(jù)值推算出待測(cè)副溶血性弧茵菌液的絕對(duì)計(jì)數(shù)值。圖菌液砷。值與顯微鏡下絕對(duì)計(jì)數(shù)值的相關(guān)性，注：對(duì)應(yīng)方程為：，），：顯微鏡下絕對(duì)計(jì)數(shù)值（個(gè)），工：值。數(shù)據(jù)來(lái)源于株不同的副溶血?jiǎng)俟萝淼囊鹨簻y(cè)定值。使用部分序列鑒定副溶血性弧菌部分序列擴(kuò)增使用序列檢測(cè)的株副溶血性弧菌和作為對(duì)照的株其他臨床分離菌株（）均擴(kuò)增出的目的片段，空白對(duì)照為陰性。電泳

19、位置正確（圖）。奄苦葛暑口莖墨重慶醫(yī)科大學(xué)硬士研究±學(xué)位論文：一；分子標(biāo)記（，天根生化科技有限套司，北京）：空白對(duì)照；：目的片段，（，（），）；，；測(cè)序比對(duì)結(jié)果株菌株的測(cè)序長(zhǎng)度在之間，平均測(cè)序長(zhǎng)度為。株（）副溶血性弧菌鑒定結(jié)果與生化培養(yǎng)法一致，株從腹瀉患者分離的副溶血性弧菌分別鑒定為科氏葡萄球菌（，表皮葡萄球菌（）和（暫無(wú)對(duì)應(yīng)的中文名稱。作為對(duì)照的株其它臨床分離菌株投有誤削為副溶血性弧苗的例證。其中株（）臨床分離菌與生化培養(yǎng)法鑒定結(jié)果一致，包括株奇異變形桿菌和株鮑氏不動(dòng)桿菌的牲定結(jié)果與臨床牛化培養(yǎng)法的結(jié)果完全符臺(tái)，株（）有差異。株（）自廉分離菌與生化表型鑒定結(jié)果有差異（表）：株（）自

20、床分離苗的比對(duì)結(jié)果中，最佳配結(jié)果和次級(jí)匹配結(jié)果的得分相可，兩序列的差異度為，不能與生化表型法的結(jié)糶相區(qū)分（表）。表對(duì)鑒定毫自生袁型墓定有著蔓異的茸株￥？重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文表型姜定釜鑒定結(jié)果比對(duì)相似覆蓋度度大肪埃希酋肺炎克需伯茸銅綠假單胞筲嗜麥芽窄食單胞茵金黃色葡萄球菌￥溶血性葡萄球菌人葡萄球菌）￥表皮葡萄球酋木糖葡萄球菌星座鏈球茸糞腸球茵弗氏志賀茼志賀茵屬普通變形桿菌赫氏埃希茸產(chǎn)酸克雷伯菌產(chǎn)氣腸桿茼陰溝腸桿茵大腸埃希茼脅膝狀假單胞菌膝狀假單胞茵不動(dòng)桿菌屬紋帶棒狀桿菌里吊葡萄球茵馬胃葡萄球菌，志賀菌屬萊個(gè)種。金黃色葡萄球茸）￥溶血性葡萄球菌，糞腸球茼。大腸埃希茵中間鏈球茸腳細(xì)叩刪伽招

21、朋忙舭希氏腸球菌打船。唾液鏈球茵鶉雞腸球苗藝屎腸球茸墨壁壘墮墅！塑！竺竺絲業(yè)竺一一！羞墮墮墮墅絲絲翌竺！地坐！壁壁絲！壁壁絲，暫無(wú)對(duì)應(yīng)的中文名稱表最佳匹配與表型鑒定法結(jié)果不同但次匹配相同的菌株情況表型鑒定釜霉囊鑒定結(jié)果耋蓋菱相似度金黃色葡萄球茵妻竺曼葡萄球箜金黃色葡萄球茵銅綠假單胞茵艦砌舢刪鯽吶聊烹篇：黛怒舢蚴脅銅綠粵單胞茵糞腸球茵尿腸球茸重慶科人學(xué)碩士研究±學(xué)位論立溶血弧菌與株其它臨床菌株序列的比對(duì)圍困副溶血弧茵及其它帖床菌株序列匕對(duì)圈！嬲；蠹。薰巍垂避嫩簇囊二譽(yù)。炭；蔞慧瀵；瑟融囊囊毒麟囊鏊；辮。囊熬饕滋蘼蔞垂謄簇；器攀曩蒸墓。；囊攔墓。；謄蠹囂震一震；蓬、疆；墓墓墓譽(yù)墓蘸萎耄墓

22、震，。：墓器警口口口？口口一一¨一駐燕鍪縫鬟善簍囊蠹墓喜二囊蠹蕊口一一震囂籬基震戤？】¨口口口口一一；，鬟謄露：瓣蓬；霧癸雛霪噩囂囊鬟；口口一一一一一鹱囊；零褥；霪垂鬻霉；黧豢篡露一翌一。一。；：。罡。蠢：娶！蠢器裟一麓蒸黧。簍蠶；嚷囂荔蕈囂荔；震蠹；謄荔囂藩豢簍基譽(yù)繁辮簍荔縫舞霧羞蛩；器謄霧翳露黜囂嬲星蟄燃鬟蠢臻蠢簍簍露霧；薰；器鍪一囂罌霆東碰囂囂囂囂盛哥囂辮耋簿耋器重慶科大學(xué)碩±研究生學(xué)位論文目注：奉圖示范性地顯示林副離血性孤茵和椿其它臨床茼蚌（舢卯叫肋刪）的序列比對(duì)蛄果共同保守堿基在比對(duì)序列下方用“嘬示比對(duì)序列范田為標(biāo)識(shí)，在第赴。螄恒哦口，），“一”致病性副

23、溶血性弧菌基因檢測(cè)基因的擴(kuò)增使州普通方法對(duì)腹瀉患青水產(chǎn)品和水樣三種來(lái)源分離的副溶血性弧菌（）：增，幽基因，共有株為菌，水樣中無(wú)株。株幽株均擴(kuò)增出長(zhǎng)度為的¨的片段，位置在處（圖）。焉一仍重慶醫(yī)科大學(xué)硬士研究生學(xué)位論文基因的檢出腹瀉患者和環(huán)境中的副溶血性弧菌株分別為（），（）。兩種來(lái)源的副溶血性弧菌基因的檢出率有顯著差異，）（表）。表臨床與環(huán)境分離的副溶血性孤茼砌基因檢出注：；船，（實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)結(jié)果隨機(jī)選擇株砌副溶血性弧菌定量基因拷貝水平。個(gè)復(fù)管的基因標(biāo)準(zhǔn)濃度測(cè)定的重復(fù)性符合要求（圖）?？瞻讓?duì)照在個(gè)循環(huán)內(nèi)不能檢測(cè)到值，顯示該反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度小于個(gè)拷貝“。其拷貝數(shù)（拷貝斗）的對(duì)數(shù)與值呈

24、線性關(guān)系（，）（圖）。從株試驗(yàn)菌的定量結(jié)果可看出，根據(jù)待測(cè)菌株的值可計(jì)算基因的拷貝數(shù)，與待測(cè)菌液的絕對(duì)計(jì)數(shù)值比較可計(jì)算基因的群體拷貝水平（表）。圖標(biāo)準(zhǔn)定量砌基因模板（拷貝）實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增曲線（）重慶科大學(xué)頊±研究學(xué)傅論立二口：十十卜十一燃甘麟勰攢嫩搟釋肝肝陣蚪聾堡群”撕兒暉廿仆拈女一分剮代表標(biāo)準(zhǔn)定量基因模板?？截悾结槻捎靡唬?biāo)記，所甩儀器為（），洲定通道為。一）圍基因起始持貝敷的對(duì)數(shù)值與值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，。玎（）對(duì)應(yīng)的方程為一目，卸（），：值模板起始拷貝數(shù)”拷貝）。重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文表十七株副溶血性孤茵的基因平均拷貝濃度神奈川溶血試驗(yàn)，脲酶反應(yīng)和基因鑒定致病性副溶血性弧菌的能

25、力比較神奈川溶血試驗(yàn)腹瀉患者，水產(chǎn)品和水樣三種來(lái)源分離的副溶血性弧菌中，菌株分別為（），（）和（）。三種來(lái)源的副溶血性弧茵的溶血反應(yīng)有顯著差異（）（表）。表臨床與環(huán)境分離的副溶血性孤茵的神奈川溶血反應(yīng)注：。（）重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文脲酶反應(yīng)株為脲酶陽(yáng)性，其中株來(lái)自腹瀉患者，株來(lái)自水樣標(biāo)本。兩組副溶血性弧菌的脲酶反應(yīng)有差異（）（表）。表臨床與環(huán)境分離的副溶血性孤茵的脲酶瓦應(yīng)注：，（）脲酶，神奈川溶血反應(yīng)與基因檢測(cè)相關(guān)性臨床與環(huán)境分離的副溶血性弧菌中，株分別為（），（）。兩種來(lái)源分離的脲酶陽(yáng)性副溶血性弧菌中，株分別為（），（）（表）。表脲酶，神奈川溶血反應(yīng)與基因檢測(cè)相關(guān)性，重慶醫(yī)科大學(xué)碩士

26、研究生學(xué)位論文討論海產(chǎn)品是人類生活重要的食物來(lái)源之一。副溶血性弧菌廣泛分布于近海岸海水和魚(yú)蝦，貝類及鹽漬加工的海產(chǎn)品中，是引起許多沿海國(guó)家由食用海產(chǎn)品致食源性疾病的重要病原體之一。但是，自然環(huán)境和水產(chǎn)品中分離得到的大多數(shù)副溶血性弧菌都無(wú)致病性，為致病菌【丌。因此準(zhǔn)確鑒定出致病性副溶血性弧菌，是對(duì)海產(chǎn)品實(shí)行衛(wèi)生檢疫控制，保障食品安全的一項(xiàng)要求。曾使用神奈川溶血實(shí)驗(yàn)將副溶血性弧茵分為陽(yáng)性和陰性兩類，對(duì)應(yīng)致病性和非致病性群。大多數(shù)從水產(chǎn)品（）和環(huán)境中（）分離的副溶血性弧茵為神奈川現(xiàn)象陰性，而多數(shù)（）臨床患者標(biāo)本分離的菌株是神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性【】。但近來(lái)發(fā)現(xiàn)神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性并不完全對(duì)應(yīng)于副溶血性弧菌的致病性

27、【。此外，大腸埃希菌，志賀氏茵，普通變形桿菌，葡萄球菌等也是經(jīng)食源性傳播可引起腹瀉或食物中毒的細(xì)菌，其腹瀉患者的炎癥反應(yīng)與副溶血性弧菌感染菌者相似。因此，在準(zhǔn)確檢測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌時(shí)也應(yīng)與這些混雜菌區(qū)分開(kāi)。使用部分序列鑒定副溶血性弧菌本研究中，我們對(duì)株副溶血性弧菌和株臨床分離菌株用針對(duì)的引物擴(kuò)增的的目的片段。產(chǎn)物測(cè)序以方式比對(duì)，細(xì)菌鑒定至種。株副溶血性弧茵鑒定正確，株從腹瀉患者分離的副溶血性弧茵分別鑒定為科氏葡萄球菌（，表皮葡萄球菌（）和。作為對(duì)照的株其它臨床分離菌株沒(méi)有誤判為副溶血性弧菌的例證。該結(jié)果表明，本文建立的分析可以作為副溶血性弧菌的一個(gè)鑒定標(biāo)準(zhǔn)。在株臨床分離菌株中，有株的鑒定

28、結(jié)果與生化培養(yǎng)法有差異。具體差異類型為株（）大腸埃希菌經(jīng)基因鑒定為志賀屬菌（例志賀菌屬某種，例弗氏志賀菌），株（）大腸埃希菌被鑒定為普通變形桿菌。大腸埃希茵與志賀菌屬的相關(guān)性為【，但是如腸侵襲性大腸埃希菌與志賀菌的生化性狀幾乎相同【，¨們，生化培養(yǎng)法很難區(qū)分，因此可通過(guò)序列分析重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文進(jìn)行區(qū)分。變形桿茵在固體培養(yǎng)基會(huì)出現(xiàn)遷徙生長(zhǎng)，而大腸埃希茵無(wú)此反應(yīng)。被鑒定為變形桿菌的兩個(gè)大腸埃希菌株重新在血平板培養(yǎng)后，有一株出現(xiàn)明顯波紋狀菌落形態(tài)，證實(shí)是變形桿菌。株（）肺炎克雷伯菌經(jīng)鑒定分別為產(chǎn)氣腸桿菌，陰溝腸桿菌，產(chǎn)酸克雷伯菌（株），（株）?？死撞鹋c產(chǎn)氣腸桿菌的同源性為引，但二者的的基因（）相似性為，有建議將產(chǎn)氣腸桿菌分類至克雷伯菌屬【，。產(chǎn)氣腸桿菌會(huì)出現(xiàn)動(dòng)力和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性延遲反應(yīng)（天），因此標(biāo)準(zhǔn)的生化（小時(shí)）鑒定會(huì)將其誤鑒定為肺炎克雷伯菌【¨。在年從臨床標(biāo)本和植物中得到鑒定，通過(guò)檢測(cè)，刀狙，椰，卻和基因認(rèn)為該菌株包括肺炎克雷伯茵第三群（），并認(rèn)為一些（）早期被鑒定為肺炎克雷伯菌的臨床菌株實(shí)際是陽(yáng)，咖腸【】。生化培養(yǎng)法的原理是通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物來(lái)判斷其分解代謝特征從而達(dá)到鑒定細(xì)菌的目的。但是由于細(xì)菌生長(zhǎng)條件的差異，株系之間的生化代謝型差異較大，可能會(huì)不小于屬種之間的距離，因此用于細(xì)菌的