異種輸血——獼猴受輸豬紅細胞的初步研究

1、異種輸血獼猴受輸豬紅細胞的初步研究           作者：檀英霞，季守平，盧雁平，張成林，李立立，宮鋒，張金國，章?lián)P培【摘要】  本研究的目的是改造豬紅細胞（pRBC）表面抗原，使之與靈長類動物相容，以探討異種輸血的可能性。結(jié)合使用半乳糖苷酶(AGL)酶解和甲氧基聚乙二醇（mPEG）修飾改造豬紅細胞表面異種抗原，并輸注給獼猴，觀察pRBC在獼猴體內(nèi)活存時間及安全性；使用免疫抑制劑（蛇毒因子CVF和地塞米松）延長pRBC在獼猴體內(nèi)的存活時間；建立失血性貧血獼猴模型，觀察輸注pRBC治

2、療失血性貧血獼猴的可能性。結(jié)果表明： AGL酶解能夠去除豬紅細胞表面主要異種抗原（Gal抗原），減弱其與獼猴血清的凝集反應，酶解技術(shù)與mPEG修飾技術(shù)結(jié)合可以使豬紅細胞與獼猴血清更為相容。異種輸血試驗表明，雙修飾的pRBC在獼猴體內(nèi)存活時間為12小時，使用免疫抑制劑后，可延長至40小時；pRBC在獼猴體內(nèi)8小時的存活率為38，在輸注pRBC的8小時內(nèi)，失血獼猴的血紅蛋白和紅細胞壓積可維持在失血前的正常水平。結(jié)論：改造后的pRBC可安全地輸注給獼猴，改善失血獼猴的貧血癥狀，提示用豬紅細胞進行異種輸血是可能的。 【關(guān)鍵詞】  豬紅細胞Preliminary Study  on&

3、#160;  Xenotransfusion from Porcine Red Blood Cell into Rhesus  MonkeyAbstract  In order to study the possibility of xenotransfusion from porcine red blood cell (pRBC) to primate，the antigens on pRBC surface were modified to make it more compatible to primate sera. Porcine RBCs were s

4、ubjected to both enzymatic removal of membrane -Gal antigens with recombinant -galactosidase (AGL) and covalent attachment of succinimid propionate-linked methoxypolyethyleneglycol (mPEG-SPA) to camouflage non-Gal antigens. The effects of double modifications were determinated by hemagglutination an

5、d clinical cross-match testing with rhesus sera. In vivo clearance rates and safety of modified pRBCs were measured after it was  transfused into Rhesus monkey with or without  immunosuppressant treatment .The validity of pRBC was detected in exsanguine Rhesus monkey model. The results sho

6、wed that AGL could effectively remove -Gal xenoantigens on pRBC membrane and reduce hemagglutination. The combination of mPEG modification with AGL treatment could significantly increased compatibility between pRBCs and Rhesus monkey  sera. Modified pRBCs were detectable in Rhesus monkey blood

7、at 12 hours after transfusion，and their survival time was 40 hours in the immunosuppressant-treated Rhesus monkey.  In vivo  survival rates  of pRBCs  were 38% in exsanguine Rhesus monkey at 8 hours after transfusion，and during that time，the hemoglobin and hematocrit of Rhesus mo

8、nkey were maintained at the same level as  before it lost blood. It is concluded  that the modified pRBC can be safely transfused into Rhesus monkey and relieve the anemic symptom exsanguine Rhesus monkey . It suggested that pRBC can be hopefully used as a blood substitute for primate and

9、human in the future.Key words  porcine red blood cell；Gal1-3Gal；-galactosidase；methoxypolyethyleneglycol；xenotransfusion  blood    血液供應的嚴重短缺是臨床輸血面臨的難題。豬血液生理生化指標與人類非常接近，無傳染甲肝、乙肝和艾滋病等疾病的危險，因而近年來人們開始探討豬紅細胞作為人類紅細胞替代品的可能性，以緩解血源緊張的矛盾1-4。    豬紅細胞輸給人體會產(chǎn)生強烈的排斥反應，這主要是由豬

10、紅細胞表面的異種抗原引起的。研究證明豬紅細胞表面存在兩類異種抗原，即-半乳糖(-Gal)抗原和非半乳糖(non-Gal)抗原。-Gal抗原是主要異種抗原，它表達于除人和舊大陸猴外的所有哺乳動物體內(nèi)，只是種類和個體間表達量有所差異5-7。人體內(nèi)存在天然抗-Gal抗體，如果將豬細胞、組織和器官移植給人和靈長類，  人和靈長類會出現(xiàn)超急性排斥反應（HAR），導致移植物被迅速清除。研究表明，使用半乳糖苷酶（AGL）能有效清除豬細胞表面Gal1-3Gal抗原（-Gal抗原）末端的-Gal殘基，減弱HAR的程度，延長移植物的存活時間2，8，9。甲氧基聚乙二醇（mPEG）是無毒性、無免疫原性的高分

11、子化合物，已被用于修飾蛋白和多肽類藥物，延長藥物的半衰期，提高治療效果。國外和我們前期的研究均表明，mPEG可與人紅細胞膜表面的-NH2、-OH共價結(jié)合，非特異性地遮蔽血型抗原，修飾后的紅細胞與相應抗血清的凝集反應減弱或消失10，11。本研究結(jié)合AGL酶解技術(shù)和mPEG修飾技術(shù)，改造豬紅細胞（pRBC），檢測改造后的pRBC與獼猴血清的相容性。在此基礎(chǔ)上，把雙修飾的pRBC輸注到獼猴體內(nèi)，觀察雙其在獼猴體內(nèi)的活存時間，探討異種輸血的可能性。材料和方法血液和試劑豬血液為無特定病原體的豬血，由北京市SPF育種中心提供；抗體：Isolectin B4-Biotin（Sigma），Streptavid

12、in-FITC（Southern Biotech，USA）；試驗獼猴及獼猴血清由北京市動物園提供；基因重組咖啡豆半乳糖苷酶（rCAGL，簡稱AGL）為本研究室研制；mPEG-SPA（20 kD）購自美國Nektar。血液標本的采集與處理頸靜脈采豬血，肝素抗凝，4保存?？鼓娜?00×g離心5分鐘，棄上層血漿，生理鹽水洗滌沉淀紅細胞。AGL改造豬紅細胞及-Gal抗原清除取壓積pRBC，用等滲磷酸-檸檬酸-NaCl緩沖液（58 mmol/L Na2HPO4，21 mmol/L檸檬酸C6H8O7?H2O，77 mmol/L NaCl，pH 5.6±0.5，PCS）洗滌4次，按每

13、毫升PCS紅細胞懸液中添加酶量為0、50、100 U，分別加入AGL，26反應2小時，PBS（pH 7.4）洗滌。    用PBS將酶解前后的pRBC稀釋為0.2懸液，1.5%的多聚甲醛固定，室溫過夜，加入生物素標記的IB4凝集素，24反應2小時，PBS洗滌后加入FITC-鏈親和素，24反應30分鐘，PBS洗滌，用流式細胞儀（FACS Calibur，Becton Dickinson）檢測紅細胞表面的熒光強度，計算-Gal抗原的清除率。酶解后的豬紅細胞(EpRBC)的mPEG-SPA修飾用PBS（pH 8.0）洗滌酶解后的pRBC 4次，稀釋成12%細胞懸液，在紅

14、細胞懸液中加入mPEG-SPA至終濃度為1.0，2.0，3.0 mmol/L，混勻后25反應1小時，PBS洗滌紅細胞。紅細胞與mPEG結(jié)合的兩相法檢測文獻報道12，13，PEG8000 (Sigma) 和葡聚糖T500 (Pharmacia) 組成的兩相系統(tǒng)(5%葡聚糖 T500、3?5% PEG8000、0.15 mol/L NaCl、6.84 mmol/L Na2HPO4、3.16  mmol/L NaH2PO4，pH 7.4)可分離mPEG修飾的紅細胞。用50 ml的聚丙烯離心管盛兩相溶液，室溫靜止過夜，分層后，用吸管吸取上相（PEG），試管底部扎孔收集下相（葡聚糖），棄中間層

15、（上下相在3天內(nèi)使用）。取上、下相各500  l于EP管中混合，mPEG-pRBC和對照紅細胞（108 cells/ml）各10 l加到此EP管中，上下顛倒20次，靜止15分鐘，紅細胞在兩相中分配（設(shè)重復），計算上相中的細胞數(shù)與加入到系統(tǒng)中總細胞數(shù)的百分比，即為分配率，亦即被修飾的紅細胞比率。雙修飾的pRBC與獼猴血清的配血實驗2.0%的pRBC懸液20 l，與40 l獼猴血清混合，250×g離心30秒，肉眼和顯微鏡下觀察紅細胞凝集程度。少量輸血實驗5 ml AGL和mPEG修飾的壓積pRBC，PBS(pH 7?2)洗滌，加入異硫氰酸熒光素（FITC，Sigma）37反應2

16、0分鐘，生理鹽水洗滌，重懸至壓積為50。在輸血前，將受血猴麻醉，分為3組： 自身輸血組，受血猴取出10 ml猴血，離心去白細胞，熒光素標記后回輸；無免疫抑制劑試驗組，將10 ml經(jīng)FITC標記的雙修飾pRBC經(jīng)靜脈輸入受試獼猴（體重約為6.0 kg）；免疫抑制劑試驗組，將10 ml經(jīng)FITC標記的雙修飾pRBC經(jīng)靜脈輸入受試獼猴，受試猴接受免疫抑制劑處理。具體免疫方法為：在輸血前24小時，按0.05 mg/kg體重的量將蛇毒免疫抑制因子眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF)，中國科學院昆明動物研究所研制靜脈注射給受試猴，并在輸血前半小時靜脈注射地塞米松（5 mg，0.5

17、mg/kg）以及第二次注射CVF（200 g，0?02  mg/kg），輸血后1小時再次靜脈注射地塞米松（5 mg）。整個試驗過程中，監(jiān)測受試猴的心率、血壓；在輸血后的5、10、15、30分鐘及1、2、4、8、12、24、28、32、36、40、44、48小時取血，流式細胞儀檢測熒光細胞百分率，計算pRBC在獼猴體內(nèi)的活存時間，并在輸血4小時后進行血常規(guī)、血生化和尿常規(guī)檢測。失血猴模型輸血實驗從獼猴體內(nèi)放血12（體重10 kg，放血100 ml），建立失血性貧血獼猴模型。將實驗分為兩組，其中一組輸入相同體積代血漿（羥乙基淀粉-鹽水注射液），另一組使用免疫抑制劑處理受試猴（方法同少量輸

18、血試驗），輸入相同體積雙修飾的pRBC (40 ml壓積紅細胞)和代血漿（50 ml），靜脈滴注輸血，然后檢測失血前后及輸血/液后不同時間點的血紅蛋白(Hb)和紅細胞壓積(Hct)，并在放血前及輸血/液4小時后進行獼猴的血生化、尿常規(guī)檢測，記錄獼猴心率、血壓變化。結(jié) 果AGL酶解改造后的豬紅細胞表面抗原分析IB4凝集素可特異地與以-Gal為末端的多糖結(jié)合14，用來檢測酶解前后pRBC表面-Gal抗原的變化情況。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，以未酶解pRBC的熒光標記率為100，使用50 U/ml的AGL可有效清除pRBC表面主要異種抗原-Gal抗原，清除率達99.42%（圖1）。紅細胞與mPEG結(jié)合

19、的兩相法檢測圖2為mPEG-SPA修飾的酶解后的豬紅細胞在兩相中的分配，從圖中可看出未修飾的紅細胞分布在界面下相，mPEG修飾的紅細胞均勻分布在上相，mPEG-SPA濃度為2.0 mmol/L時，80%的mPEG-RBC分布在上相，mPEG-SPA為3.0 mmol/L時，紅細胞的修飾率大于90%。這種技術(shù)對于規(guī)模化分離回收被修飾的紅細胞和應用于輸血是非常重要的。AGL酶解和mPEG-SPA遮蔽雙修飾的pRBC與獼猴血清的配血試驗AGL基本清除了pRBC表面的-Gal抗原后，配血試驗顯示，EpRBC與猴血清仍然有凝集反應，但凝集程度有所減弱（從+降到+），凝集時間延長。進一步使用mPEG-SP

20、A修飾EpRBC，鏡檢結(jié)果表明，隨著mPEG-SPA濃度的升高，修飾的pRBC與獼猴血清的鹽水凝集反應逐步減弱，當mPEG濃度為2.0  mmol/L時，鹽水凝集反應完全消失（圖3），這說明AGL和mPEG-SPA雙修飾能有效清除和遮蔽豬紅細胞表面主要和非主要異種抗原。百事通 少量輸血試驗所有受試猴在輸血過程中和輸血后，呼吸、心率、血壓和血氧飽和度均無大幅度的波動，無明顯的輸血反應癥狀出現(xiàn)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，輸入的pRBC約占獼猴體內(nèi)總紅細胞數(shù)量的4左右，這與理論值是一致的，以此為100，計算輸血后不同時間點pRBC存活的百分率。檢測結(jié)果表明：自身回輸組，3天后檢測紅細胞存活率

21、在90%以上；無免疫抑制劑試驗組，在輸血后12小時時仍可檢測到FITC標記的pRBC；免疫抑制劑試驗組，輸血8小時時有38%pRBC存活，而在輸血40小時后，獼猴體內(nèi)仍可檢測到熒光標記的pRBC（圖4）。    受試猴的尿常規(guī)和血生化等多項指標檢測表明，各組的血清K、尿素氮，膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶等均有一定程度的上升。值得注意的是，無免疫抑制劑試驗組總膽酸升高了15倍。尿常規(guī)指標中，無免疫抑制劑試驗組受試猴在輸豬紅細胞后，尿液中出現(xiàn)大量的尿膽原，尿蛋白和尿紅細胞（均為+）；而免疫抑制劑組在輸豬紅細胞后，尿液中未出現(xiàn)尿膽原和尿蛋白，僅紅細胞有略微的增加，與自身回輸組相似（表

22、1）。這些結(jié)果說明使用免疫抑制劑可減輕異種輸血的免疫反應。Table 1. Blood and urine biochemical analysis  of autologous blood transfusion Rhesus monkey and transfused pRBC Rhesus monkey with or without immunosuppressant (CVF) treatment（略）失血性貧血獼猴的pRBC治療為了檢測雙修飾后pRBC是否在獼猴體內(nèi)行使紅細胞的功能，我們建立了失血性貧血獼猴模型。獼猴失血約12后，輸入代血漿-羥乙基淀粉，恢復血容量，失血獼

23、猴出現(xiàn)貧血癥狀，表現(xiàn)為面色蒼白，血紅蛋白和紅細胞壓積降低等（3小時內(nèi)Hb降低了15%，RBC降低了13%）（圖5）。失血后3小時，獼猴血清中乳酸脫氫酶(LDH，乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶)的水平升高了約5倍，說明動物無氧酵解水平上升，提示動物處于缺氧的狀態(tài)；而輸入雙修飾pRBC治療的貧血獼猴，面色紅潤，輸血3小時后，LDH僅為放血前的1.5倍，明顯低于未治療貧血猴（表2）；其它生化指標變化不大。在輸血后8小時內(nèi)，受試猴體內(nèi)血紅蛋白和紅細胞壓積與失血前一致（圖5），維持正常水平，而未治療的獼猴在失血18小時內(nèi)一直表現(xiàn)典型的貧血癥狀。這說明經(jīng)酶解和mPEG包裹的雙修飾豬紅細胞輸給獼猴在一定時間內(nèi)可發(fā)

24、揮正常的攜氧功能，因此失血獼猴未出現(xiàn)失血后的貧血癥狀。這一結(jié)果提示異種輸血的可能性。Table 2.  Blood and urine biochemical analysis  of hemorrhagic Rhesus monkey and pRBC treated hemorrhagic Rhesus monkey（略）討 論據(jù)統(tǒng)計，我國每年的血液需求量為50億毫升，但目前的供應量僅為16億毫升，供需之間存在巨大差距，血液來源問題已經(jīng)成為制約臨床輸血應用的瓶頸。在實行義務獻血法后供需矛盾更顯突出，很多病人由于不能及時獲得輸血治療而延誤搶救的最佳時機。為解決這一矛盾，人

25、們開始尋找紅細胞代用品，其中以化學修飾的牛血紅蛋白和納米氟碳乳劑最為成功，但它們不完全具備有形紅細胞的功能。豬紅細胞無論從形態(tài)、結(jié)構(gòu)，還是生理功能、生化特征，都與人紅細胞極為相近，近年來逐漸成為人紅細胞代用品研究的對象。    研究表明，將豬的細胞或器官移植到人體內(nèi)，會引起強烈的免疫排斥反應，主要是超急性排斥反應（HAR），人血液中的天然抗體與豬細胞表面主要異種抗原Gal結(jié)合，激活補體系統(tǒng)，導致在數(shù)分鐘內(nèi)被排斥。去除豬細胞表面的Gal抗原、抑制補體系統(tǒng)激活、清除人體內(nèi)的天然抗體是克服HAR的三條技術(shù)途徑。異種輸血比異種器官移植更有可能實現(xiàn)，因為成熟紅細胞無核，缺乏

26、細胞器，使用AGL可永久去除pRBC的-Gal抗原。    為克服異種輸血的HAR，我們首先使用基因重組咖啡豆-半乳糖苷酶(AGL)處理pRBC。結(jié)果表明，AGL可以有效地清除pRBC表面的-Gal抗原，AGL濃度為50 U/ml時，抗原清除率達到99.4%以上。然而，AGL處理的pRBC與猴血清仍有弱凝集反應。這可能是由于pRBC表面還存在nonGal抗原或殘存少量的-Gal抗原分子，因此必須將異種抗原完全去除或遮蔽。為此，我們進一步用SPA端基活化的mPEG修飾AGL處理過的pRBC，mPEG-SPA與紅細胞膜蛋白以酰胺鍵的形式共價結(jié)合10，其形成的高度水化膜

27、和柔韌的長鏈阻止抗體等大分子的進入，對抗原起到空間遮蔽作用。隨著mPEG-SPA濃度的升高，pRBC與獼猴血清的鹽水凝集反應進一步減弱，當mPEG的濃度大于2.0  mmol/L，凝集反應消失，提示雙修飾的pRBC與獼猴血清基本兼容。Doucet等3的研究結(jié)果表明，雙修飾對豬紅細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能和變形性等均無明顯影響，我們前期的工作也得到了相同的結(jié)論。    據(jù)文獻報道，Eckermann等2曾用pRBC、AGL處理的pRBC、AGL處理的pRBC配合使用免疫抑制劑（CVF，補體抑制劑）及結(jié)合使用BSA-Gal分別輸給1只猩猩，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pRBC

28、相應的存活期分別為不到15分鐘、2小時、24小時和72小時。我們將雙修飾的pRBC對未處理獼猴進行少量輸血試驗，結(jié)果顯示 pRBC相應的存活期為12小時，比Eckermann報道的存活時間長5倍。我們的實驗還表明，使用CVF和地塞米松處理獼猴進行大量輸血試驗，輸血8小時后約有38的pRBC存活，輸血40小時后仍可檢測到pRBC。結(jié)果說明mPEG可以遮蔽豬紅細胞表面的non-Gal抗原，使之與獼猴體內(nèi)的天然抗體的反應能力減弱，降低遲發(fā)型排斥反應的程度；雙修飾的方法明顯優(yōu)于AGL單處理法，能顯著降低異種輸血排斥反應的程度。    我們首次用雙修飾的pRBC配合使用免疫

29、抑制劑治療失血性貧血獼猴，輸血后8小時內(nèi)，受血獼猴的Hb和Hct恢復到和失血前水平，失血猴未出現(xiàn)面色蒼白等貧血癥狀，說明經(jīng)酶解和mPEG包裹雙修飾的豬紅細胞可在一定時間內(nèi)在獼猴體內(nèi)發(fā)揮正常的攜氧功能，因此失血獼猴未出現(xiàn)貧血癥狀，尤其是在輸入修飾的pRBC后，血清中LDH水平升高幅度較貧血猴低，說明輸入的豬紅細胞能夠緩解動物的缺氧狀態(tài)。    在給獼猴輸入雙修飾的pRBC的異種輸血過程中，獼猴的呼吸、心率、血壓和血氧飽和度等指標均沒有明顯變化，這提示在異種輸血過程中受血獼猴的生命指標是平穩(wěn)的，未出現(xiàn)劇烈的輸血反應。無免疫抑制劑試驗組獼猴的尿膽原，尿蛋白和尿紅細胞均出

30、現(xiàn)強陽性，而使用免疫抑制劑試驗組和自身回輸對照組在尿中僅檢測到少量的紅細胞。我們推測，其機理是使用CVF抑制受試猴體內(nèi)的補體系統(tǒng)，減弱了IgG介導的補體激活途徑，減輕了肝臟和腎臟損傷，因此免疫抑制劑試驗組的血生化和尿常規(guī)檢查指標均較無免疫抑制劑組正常。    試驗結(jié)果提示將經(jīng)修飾的pRBC輸注給獼猴，即異種輸血是有可能的。本研究結(jié)果為實現(xiàn)將pRBC作為人紅細胞代用品，以及用pRBC搶救失血的珍稀動物，提供了有意義的參考。 【參考文獻】  1Zhu A. Intruduction to porcine red blood cell: implic

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