《生物技術(shù)實(shí)踐》識(shí)記內(nèi)容

1、生物技術(shù)實(shí)踐講義實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離以及分離以尿素為氮源的微生物知識(shí)要點(diǎn)： 微生物是指結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物，有細(xì)胞壁（肽聚糖）、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，無(wú)成型的細(xì)胞核，只有一環(huán)狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色液處理，細(xì)菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類(lèi)，區(qū)別在細(xì)胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌，在腸道中一般對(duì)人無(wú)害，但也有一些菌株對(duì)人體是有害的，可以侵襲腸黏膜

2、并產(chǎn)生毒素。但是，任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。細(xì)菌的分離方法有兩種：劃線分離法和涂布分離法。是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。劃線分離就是用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線的過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線最后，可使細(xì)菌間的距離加大。將接種后的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)1020小時(shí)后，一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞就會(huì)繁殖成許多細(xì)菌細(xì)胞，這些細(xì)胞緊緊聚集在一起，形成菌落，不會(huì)重疊。在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。用于基因工程的大腸桿菌的工程菌，可以用劃線分離法獲得產(chǎn)物表達(dá)能力高的菌株。由于工程菌的質(zhì)粒中通常有

3、抗性基因（如抗氨芐青霉素基因），如在培養(yǎng)基中加入一定量的氨芐青霉素，由于非工程菌的其他雜菌都沒(méi)有抗性基因，所以在劃線后只有存在抗性基因的工程菌能生存下來(lái)。 涂布分離時(shí)，需要先將培養(yǎng)的菌液稀釋?zhuān)ǔＯ♂?0-510-7倍，然后取0.1ml稀釋度不同的菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可培養(yǎng)得到相互分開(kāi)的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿中有20個(gè)以?xún)?nèi)的單菌落為最合適。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜。  在培養(yǎng)微生物時(shí)，必須進(jìn)行無(wú)菌操作。其首要條件是各種器皿

4、必須是無(wú)菌的，如各種大小的培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、取樣器的頭（或稱(chēng)“槍頭”）、稱(chēng)液管、三角刮刀、接種環(huán)、鑷子等等。這些用具通常用高壓蒸汽滅菌法滅菌。各種培養(yǎng)基也必須是無(wú)菌的，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基、倒平板、接種、平板劃線、平板稀釋涂布等操作中的每一步都要做到無(wú)菌，必須在酒精燈火焰旁操作（防止雜菌污染）。培養(yǎng)基在121 （1kg/cm2壓力）下，滅菌15min。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)中所需的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。滅菌后，通常將實(shí)驗(yàn)用具放入6080的烘箱中烘干，以除去滅菌時(shí)的水分。如果培養(yǎng)基中有葡萄糖，為防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2壓力（90以上）滅菌30min。有些不能

5、加熱滅菌的化合物，如尿素（加熱會(huì)分解），只能用G6玻璃砂漏斗過(guò)濾，但玻璃砂漏斗使用前也要在121下用紙包好滅菌。玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，要將培養(yǎng)皿倒置，是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，不倒放培養(yǎng)皿會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴后，落入培養(yǎng)基的表面并且擴(kuò)散，菌落中的細(xì)菌也會(huì)隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難在分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。  細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)要用LB液體培養(yǎng)基（通用培養(yǎng)基、常用于做生理學(xué)研究和發(fā)酵工業(yè)），劃線分離要用LB固體培養(yǎng)基（常用于微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存）?！凹?xì)菌喜葷，霉菌喜

6、素”，通常細(xì)菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來(lái)配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無(wú)機(jī)物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但其基本成分都一樣。在無(wú)菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37培養(yǎng)24h后，置于4冰箱中保存。問(wèn)題：1微生物、細(xì)菌與大腸桿菌之間有怎樣的關(guān)系？2培養(yǎng)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基中有各種物質(zhì)，為什么選擇這些物質(zhì)，這些物質(zhì)有什么作用呢？人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出了供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)基。雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有五大營(yíng)養(yǎng)要素，即水、無(wú)機(jī)鹽、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生長(zhǎng)

7、因子(不同的細(xì)菌需要的各不相同，有物種差異，它主要補(bǔ)充自身不能合成的或合成能力較弱的，但卻是生長(zhǎng)繁殖必需的物質(zhì))。無(wú)機(jī)鹽作用：維持滲透壓、pH等3該實(shí)驗(yàn)中這些操作的原因?qū)⒋竽c桿菌用接種環(huán)自斜面轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，為什么接種環(huán)必須先深入到斜面冷卻后，才能再取斜面上的菌體？接種環(huán)在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，一直灼燒至紅，溫度很高，若不冷卻就直接用其取斜面上的菌體，菌體可能因?yàn)榻佑|高溫接種環(huán)而死亡，導(dǎo)致大腸桿菌的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)失敗。用劃線法分離大腸桿菌中，第一次和隨后的幾次劃線前都要灼燒接種環(huán)，它們的原因一樣嗎？在劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)這又是為什么呢？雖然每次灼燒都是為了滅菌，但所滅的菌

8、種和原因卻不一樣。灼燒接種環(huán)的時(shí)間消滅的菌體原因第一次劃線前其他雜菌防止其他雜菌的侵入而造成污染隨后的幾次劃線前上次劃線結(jié)束后殘留在接種環(huán)上的實(shí)驗(yàn)菌(本實(shí)驗(yàn)為：大腸桿菌)為了使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌來(lái)自上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，最終獲得單個(gè)菌落，實(shí)現(xiàn)菌的分離最后一次劃線結(jié)束后殘留在接種環(huán)上的實(shí)驗(yàn)菌為了防止實(shí)驗(yàn)菌殘留于接種環(huán)而污染環(huán)境和感染實(shí)驗(yàn)人員用劃線法分離大腸桿菌時(shí)，每次的劃線是怎么樣的？對(duì)隨后的劃線的起點(diǎn)有什么要求？為什么這樣要求呢？劃線的要求：不能出現(xiàn)線條的重疊，第二次以及隨后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開(kāi)始，不要將最后一區(qū)的劃線與

9、第一區(qū)相連這樣要求的原因：使線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，因?yàn)閯澗€后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到有單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的單菌落。若相連，則可能最后一次劃線末端處的細(xì)菌與第一次的疊加，細(xì)菌的數(shù)目不是最少的，不能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終將很難獲得單菌落4消毒與滅菌一樣嗎？消毒：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100煮沸56 min 一般物品 巴氏消毒法：7075煮30 min或在80煮15 min對(duì)于

10、一些不耐高溫的液體，如牛奶 化學(xué)藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌干熱滅菌：160170 下滅菌12 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌高壓蒸汽滅菌：121 （1kg/cm2壓力）下，滅菌1530 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌課后作業(yè)1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?膽大心細(xì)，操作快捷。注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染幾率，手和實(shí)驗(yàn)服要清潔，減少操作時(shí)間，對(duì)污染源的改善考慮周到。注意微生物生長(zhǎng)條件，如pH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜中性偏堿性環(huán)境，喜蛋白質(zhì)豐富的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)

11、，喜37的溫度；而霉菌喜中性偏酸性環(huán)境，喜糖類(lèi)豐富的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，喜2530的溫度。因此，知己知彼也可以減少污染。2.培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染？ 從菌落的形態(tài)看，是否濕潤(rùn)、透明、黏稠，呈何種顏色等等，是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標(biāo)。用顯微鏡鏡檢觀察其形態(tài)、大小，看是否有菌絲、孢子、芽孢等，這也是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標(biāo)。上述方法較難區(qū)分同類(lèi)的不同物種，需要借助化學(xué)方法和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法，觀察有無(wú)鞭毛、孢子形態(tài)、孢子著生方式、菌絲生長(zhǎng)方式、芽孢、毒素及特異生理生化性質(zhì)等。3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，為什么要將培養(yǎng)皿倒置? 恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形

12、式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放培養(yǎng)皿，則水分形成的水滴會(huì)落人培養(yǎng)基表面并且擴(kuò)散開(kāi)。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的菌會(huì)隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。因此恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿必須倒置。4.實(shí)驗(yàn)完成后，接觸過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理? 實(shí)驗(yàn)完成后，所有接觸過(guò)細(xì)菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對(duì)于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌30min，再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再使用

13、。 5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的工程菌，如何保證沒(méi)有被普通的大腸桿菌污染?轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒，不是細(xì)菌中原有的質(zhì)粒，而是通過(guò)改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨芐青霉素基因。轉(zhuǎn)基因載體(質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化進(jìn)人大腸桿菌后，能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而未被轉(zhuǎn)化的就不能生長(zhǎng)，其他沒(méi)有抗氨芐青霉素基因的雜菌也不能生長(zhǎng)，這種設(shè)計(jì)保證了轉(zhuǎn)基因工程菌的純潔性。在獲得轉(zhuǎn)基因工程菌后，如果為了選擇高表達(dá)菌株等進(jìn)行分離，也可使用含抗生素的培養(yǎng)基，這就保證了轉(zhuǎn)基因工程菌不被普通(無(wú)抗性基因)的大腸桿菌所污染。實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物脲也稱(chēng)尿素，是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物。人和其他哺乳動(dòng)物的尿中都含有尿素，大量尿素的

14、存在會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。尿素也是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。有一些細(xì)菌含有脲酶，它們可以通達(dá)降解尿素作為其生長(zhǎng)的氮源。這類(lèi)細(xì)菌可以從土壤中分離出來(lái)。脲酶（NH2）2COH2O2NH3CO2本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是從土壤中分離出能利用尿素的細(xì)菌，觀察菌落數(shù)，并了解它在生態(tài)平衡中的作用。以LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為對(duì)照，觀察全營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)菌的菌落數(shù)。材料：1 在100mL燒杯中裝入50mL70%酒精，將玻璃刮刀浸泡在其中。2 在100mL三角瓶中配制好25mL全營(yíng)養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基（0.25g蛋白胨，0.12g酵母提取物，0.25gNaCl和0.5

15、g瓊脂糖，水25mL），加上封口膜后滅菌待用。3 在100mL三角瓶中配制好25mL尿素固體培養(yǎng)基（0.025g葡萄糖，0.12gNaCl， 0.12gK2HPO4，0.25g酚紅和0.5g瓊脂糖，水15mL），加上封口膜后滅菌，待冷卻至60時(shí)，加入通過(guò)G6玻璃砂漏斗過(guò)濾的10mL尿素溶液（內(nèi)含2g脲），搖動(dòng)，法例均勻后待用。4 將裝有4.5mL蒸餾水的5支有塞試管滅菌后待用。5 在250mL三角瓶中裝入99mL蒸餾水，用封口膜蓋上，滅菌后待用。6 土樣1g（從有哺乳動(dòng)物排泄物的地方取得）步驟：1 在60左右時(shí)，將兩只三角瓶中已滅菌的LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基，在酒精燈旁分別倒入兩個(gè)培養(yǎng)皿

16、中，在水平的超凈臺(tái)上搖勻，平放至凝固。2 制備細(xì)菌懸液。在無(wú)菌條件下，將1g土樣加到有99mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩10min，即成102土壤稀釋液。依此法制備10-3、10-4和10-5土壤稀釋液。取樣時(shí)，盡量只取懸液。搖勻，放在試管架上。3 用涂布分離法分離細(xì)菌。取10-4和10-5的土壤稀釋液各0.1mL，分別加到有LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，再將保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精燈火焰上，待刮刀上火焰熄滅，在酒精燈火焰旁打開(kāi)培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個(gè)平面上4 將培養(yǎng)皿倒置，在37恒溫箱中培養(yǎng)2448h。觀察菌落數(shù)5 觀察。全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中有較多的菌落，而尿素為氮源的培養(yǎng)基平板中只有

17、少量菌落。問(wèn)題探究1. 用瓊脂糖代替瓊脂配制固體培養(yǎng)基，因?yàn)榄傊俏幢患兓幕旌衔?，?nèi)含一定量的含氮化合物，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選。配制尿素固體培養(yǎng)基時(shí)，葡萄糖應(yīng)用500g/cm2壓力滅菌30min（為防止葡萄糖碳化），尿素需經(jīng)細(xì)菌G6玻璃砂漏斗過(guò)濾滅菌后加入。2. 實(shí)驗(yàn)操作中的注意事項(xiàng)設(shè)立重復(fù)組：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)時(shí)，至少要涂布3個(gè)平板作重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。對(duì)照實(shí)驗(yàn)判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染，需將未接種的培養(yǎng)基同量進(jìn)行培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基應(yīng)各有一個(gè)空白對(duì)照，即不涂布菌液，目的是驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用，需設(shè)立LB全營(yíng)

18、養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上菌落數(shù)目，進(jìn)行比較得出結(jié)論。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析培養(yǎng)基中酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株以尿素為氮源。紅色區(qū)域的大小代表脲酶活性的強(qiáng)弱和含量的多少與全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落，這一現(xiàn)象表明能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占少部分。3.鑒定方法：含酚紅指示劑、以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基細(xì)菌指示劑變紅，則該細(xì)菌能分解尿素實(shí)驗(yàn)4果汁中的果膠和果膠酶果膠是植物細(xì)胞壁以及胞間層的主要組成成分之一，它是由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯組成的一種高分子化合物，果膠起著將植物細(xì)胞粘合在一起的作用，去掉果膠，就會(huì)使植物組織變

19、得松散。果膠不溶于乙醇（也不溶于水），這是鑒別果膠的一種簡(jiǎn)易方法。在果汁加工中，果膠不僅會(huì)影響出汁率，還會(huì)使果汁渾濁。果膠酶能夠分解果膠，分解植物的細(xì)胞壁及胞間層，使榨取果汁變得更容易，而果膠分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得渾濁的果汁變得澄清。果膠酶并不是特指某一種酶，而是分解果膠的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，包括果膠酶和果膠甲酯酶等。有些微生物，如黑曲霉、蘋(píng)果青霉等都可用于生產(chǎn)果膠酶。 在食品工業(yè)，果膠酶主要應(yīng)用于水果加工業(yè)，主要有：水果中的果膠經(jīng)果膠酶水解后，可降低果汁的粘度，有助于壓榨并提高出汁率；在進(jìn)行果汁沉降和離心時(shí)，能破壞果汁中懸浮物的穩(wěn)定性，使其凝聚沉淀，果汁得到澄清；經(jīng)果膠酶處理的果汁比較穩(wěn)

20、定，不再發(fā)生混濁；在葡萄酒釀造中加入果膠酶能起到澄清作用，還可促使葡萄汁中的酒石酸發(fā)生沉淀； 本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是探究利用蘋(píng)果或山楂勻漿制作果汁的最佳條件、檢測(cè)果膠酶的活性、了解果膠酶對(duì)果汁形成的作用和收集果膠酶的應(yīng)用材料。步驟：1 用小刀除去蘋(píng)果或山楂果實(shí)中帶種子的部分，并切成塊，加入少量水制成勻漿。2 取兩個(gè)100mL的燒杯，編號(hào)A、B，各加入5g勻漿，再向A號(hào)燒杯中加入10mL黑曲霉的提取液或果膠酶溶液，B號(hào)燒杯中加入10mL水，間歇攪拌2030min。燒杯號(hào)管號(hào)處理加酒精前現(xiàn)象加酒精后現(xiàn)象A1加熱2不加熱B3加熱4不加熱3 取4支試管，編號(hào)14。將A燒杯中的混合物放入1號(hào)和2號(hào)試管中，每管放

21、入4mL；將B燒杯中的混合物放入3號(hào)和4號(hào)試管中，每管也放入4mL。將1號(hào)和3號(hào)試管放在沸水浴中或酒精燈上加熱，觀察有何變化？2號(hào)和4號(hào)試管不加熱。4 再向上述4支試管中各加入95%的乙醇4mL，觀察有什么變化？將觀察結(jié)果記入右表中。問(wèn)題：1.制作果汁的最佳條件是什么? 品質(zhì)最好的果汁應(yīng)該是：盡量保留水果中的營(yíng)養(yǎng)成分。具有水果的原始口味。有更多的固形物。分散程度好，不沉淀，不上浮。有原始的水果色彩。除去所有的機(jī)械組織，更易消化。因此，能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中的條件就是最佳條件，達(dá)到這些條件的方法要溫和，且對(duì)人體無(wú)害。2.果膠酶在制作果汁中起什么作用? 果膠是細(xì)胞間的黏連成分，也是果

22、汁中的成分，加入果膠酶可將細(xì)胞離析，增加固形物的分散度。此外，還降低了水果勻漿懸液的黏度，有利于過(guò)濾掉不溶物，并使果膠分解成半乳糖醛酸。3.果膠酶還可能有什么作用? 果膠酶除用于制備果汁外，還用于果酒澄清，同時(shí)也作為洗衣粉的添加劑。加果膠酶的洗衣粉可除去衣服上的果汁、果醬等污垢。4實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步驟中用玻璃捧間歇攪拌20 min30 min的目的是什么? 使酶和反應(yīng)物(果膠)充分接觸，有利于化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。5實(shí)驗(yàn)中加熱和不加熱有什么區(qū)別?為什么? 沸水浴中或酒精燈上加熱會(huì)使酶失活，試管中加不加酶結(jié)果都一樣；不加熱時(shí)酶保持活性，加酶的試管中果膠水解，而加水的試管中果膠不能水解。6實(shí)驗(yàn)中加入95的乙醇4

23、mL后，出現(xiàn)什么現(xiàn)象，為什么? 果膠不溶于乙醇，可以用乙醇來(lái)鑒別果膠。加入95的乙醇4 mL后，含有果膠的試管會(huì)出現(xiàn)沉淀，而果膠被水解后不出現(xiàn)沉淀。7當(dāng)探究溫度對(duì)黑膠酶活性的影響時(shí)，哪個(gè)因素是變量，哪些圖素應(yīng)該保持不變? 溫度是變量，應(yīng)控制果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時(shí)間和混合物的pH等所有其他條件不變。只有這樣才能保證只有溫度一個(gè)變量對(duì)果膠酶的活性產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)6淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)酶是生物體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)的催化劑，它有高度的專(zhuān)一性和高效性。但酶在水溶液中很不穩(wěn)定，且不利于工業(yè)化使用。固定化酶就是水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制

24、劑。固定化的方法有吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。將固定化酶裝柱，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過(guò)該柱時(shí)，在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是用吸附法將淀粉酶固定在石英砂上。一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過(guò)固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示劑溶液（KI-I2溶液）測(cè)試，流出物呈紅色，表明水解產(chǎn)物糊精生成。淀粉酶淀粉酶糖化淀粉酶淀粉糊精麥芽糖葡萄糖遇碘顯藍(lán)色遇碘顯紅色遇碘不顯色這里使用的是枯草桿菌的淀粉酶，其作用的最適H為5.57.5，最適溫度為5075材料：淀粉酶的固定化。在燒杯中將5mg淀粉酶溶于4mL蒸餾水中。由于酶不純，可能有些不溶物。再加入5g石英砂，不時(shí)攪拌，30min后裝入1支下端接有氣門(mén)心并用夾子封

25、住的注射器中（石英砂體積約為4mL）。用10倍體積的蒸餾水洗滌此注射器以除去未吸附的游離淀粉酶，流速為1mL/min步驟：1將灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液以0.3mL/min的流速過(guò)柱。在流出5mL淀粉溶液后接收0.5mL流出液，加入12滴KI-I2溶液，觀察顏色。用水稀釋1倍后再觀察顏色2實(shí)驗(yàn)后，用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱，放置在4冰箱中，幾天后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，看是否有相同的結(jié)果。問(wèn)題：1與普通的酶相比較，固定化酶有什么優(yōu)點(diǎn)？酶固定化后有一定的機(jī)械強(qiáng)度，催化反應(yīng)的過(guò)程要連續(xù)化、自動(dòng)化；酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，產(chǎn)物更易純化；固定化酶可反復(fù)使用，更

26、經(jīng)濟(jì)，更利于工廠化生產(chǎn)；固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，可較長(zhǎng)時(shí)間貯存和使用。2如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀粉酶？可在試管中加入1mL可溶性淀粉，再加入幾滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住試管增加溫度，幾分鐘后加12滴KI-I2溶液指示劑，如仍呈藍(lán)色，即流出液中沒(méi)有淀粉酶了。實(shí)驗(yàn)8果酒及果醋的制作與酒和醋的生產(chǎn)有關(guān)的微生物分別是酵母菌（真菌）和醋桿菌（細(xì)菌），它們各有不同的菌種。菌種的不同，所產(chǎn)生的酒和醋的風(fēng)味也不同。本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是制作果酒和果醋，所用的原料是葡萄或其他果汁。葡萄酒是酵母利用葡萄糖進(jìn)行酒精發(fā)酵(乙醇發(fā)酵)的產(chǎn)物。酵母菌只有在無(wú)氧條件下才能進(jìn)行酒精發(fā)酵，即將葡萄糖氧化成乙醇，

27、而且當(dāng)培養(yǎng)液中乙醇的濃度超過(guò)16時(shí)，酵母菌就會(huì)死亡。葡萄糖氧化成乙醇的反應(yīng)式如下：C6H12O62CO2+2C2H5OH醋桿菌在有氧條件下才能將乙醇氧化為醋酸，醋桿菌所產(chǎn)生醋酸可使培養(yǎng)液中醋酸的含量高達(dá)13。其反應(yīng)式如下：C2H5OH+O2CH3COOH+H2O 將適量干酵母放在一小燒杯中，加入少量溫水，使干酵母成為糊狀。為使酵母迅速發(fā)生作用，可加極少量蔗糖，混勻，放置片刻。待酵母懸液中出現(xiàn)氣泡即可。用葡萄制作葡萄酒時(shí)，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本實(shí)驗(yàn)為了加速反應(yīng)，使觀察更直觀，需要有更多底物參加反應(yīng)，所以加入酵母使酒精發(fā)酵占有優(yōu)勢(shì)。使用高錳酸鉀溶液浸泡葡萄的目的是為了防止雜菌污染，也

28、是消滅了野生酵母。發(fā)酵瓶中的液體不能裝滿(mǎn)（裝量不超過(guò)2/3）是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中氣體產(chǎn)生，如果裝滿(mǎn)會(huì)使液體外溢，導(dǎo)致發(fā)酵液損失和瓶口等處污染雜菌，影響產(chǎn)物品質(zhì)。用裝著水的彎曲玻璃管可以防止氧氣進(jìn)入，發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳可以出去，還可以防止空氣中雜菌的污染。  制醋有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，本實(shí)驗(yàn)屬于固定化菌體連續(xù)發(fā)酵工藝。制醋時(shí)要向發(fā)酵瓶中通入空氣，保證發(fā)酵是一個(gè)氧化過(guò)程，要用棉花過(guò)濾是防止空氣中的微生物進(jìn)入。問(wèn)題：1葡萄或其他果實(shí)上常有天然的野生酵母存在，為什么上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都要接種酵母？生產(chǎn)葡萄酒時(shí)一般不加蔗糖，都只用野生酵母。本實(shí)驗(yàn)為了加速反應(yīng)，使觀察更直觀，需要有更多底物（蔗糖）參加反應(yīng)

29、，所以加入酵母使酒精發(fā)酵占有優(yōu)勢(shì)是必須的。否則會(huì)有許多霉菌生長(zhǎng)，出現(xiàn)異味，影響質(zhì)量。2為什么發(fā)酵瓶中的液體不能裝滿(mǎn)？從以葡萄糖為底物發(fā)生乙醇發(fā)酵的反應(yīng)式看，1個(gè)葡萄糖分子經(jīng)乙醇發(fā)酵后要產(chǎn)生2個(gè)CO2分子，因此，發(fā)酵過(guò)程中有氣體產(chǎn)生。如果發(fā)酵液裝滿(mǎn)容器，則液體將外溢，一則發(fā)酵液會(huì)損失，二則瓶口等處會(huì)被許多雜菌污染，特別是被霉菌污染，將影響產(chǎn)物品質(zhì)，所以發(fā)酵液不能裝滿(mǎn)。3圖中裝著水的彎曲玻璃管起什么作用？裝著水的玻璃管可防止氧氣進(jìn)入。由于厭氧發(fā)酵過(guò)程中有CO2產(chǎn)生，使瓶?jī)?nèi)壓力加大，CO2氣體可以從裝有水的玻璃管中出去，減小瓶中的壓力。此外，有水封閉也起著防止被空氣中雜菌污染的作用。4制酒時(shí)必須保證

30、所有用具都是清潔的，為什么？不論是葡萄或是其他水果，對(duì)微生物來(lái)將都是良好的培養(yǎng)基，特別是霉菌?？諝庵杏性S多霉菌孢子，也有細(xì)菌，如果用具不清潔，就等于向果汁中接種了許多雜菌，它們都可以利用糖繁殖菌體。這樣，我們飲用的就不會(huì)是果酒，而是雜菌的培養(yǎng)液了，輕則會(huì)影響我們飲用的口感，重則會(huì)影響我們的健康。5為什么要向發(fā)酵瓶中通入空氣？從乙醇進(jìn)行醋酸發(fā)酵的反應(yīng)式看到，反應(yīng)是一個(gè)氧化過(guò)程，需要空氣中的氧氣，因此要向發(fā)酵瓶中通入空氣。6為什么空氣要用棉花過(guò)濾？甲瓶中的酒水混合物和乙瓶中的鋸末都含有微生物可利用的養(yǎng)分，進(jìn)入的空氣含有大量微生物，經(jīng)棉花過(guò)濾可防止微生物進(jìn)入。7你所得到的丙瓶中的液體是否就是市售的白

31、醋？為什么？怎樣才能得到白醋？市售白醋中除醋酸外，還含有豐富的不揮發(fā)性酸、糖、酯、醇等物質(zhì)，這些物質(zhì)多為加入的酵母所產(chǎn)生。只有醋酸不能達(dá)到口感好、有香氣的目的。在生產(chǎn)中將一部分丙瓶產(chǎn)物加工成成品，另一部分再與甲瓶溶液一起進(jìn)入乙瓶，這樣可增加口感。最后的成品需要調(diào)兌、過(guò)濾、化驗(yàn)，再包裝成成品，如光華白醋的流出液含酸可達(dá)9.09.5，而成品中只有5，要經(jīng)上述過(guò)程才能得到市售類(lèi)型的白醋。8.為什么在酒精發(fā)酵過(guò)程中往往“先通氣后密封”？“通氣”的目的是使酵母菌進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖?！懊芊狻钡哪康氖鞘菇湍妇M(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精 。9.酒精發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生“先來(lái)水后來(lái)酒”現(xiàn)象，其原因是什么？酵母菌首先進(jìn)行有

32、氧呼吸產(chǎn)生了水，然后進(jìn)行無(wú)氧呼吸才產(chǎn)生酒精。10.葡萄酒呈現(xiàn)深紅色的原因？在發(fā)酵過(guò)程中葡萄皮的色素進(jìn)入到發(fā)酵液中。11.酵母菌是如何進(jìn)行生殖的？酵母菌在環(huán)境適宜時(shí)進(jìn)行出芽生殖，環(huán)境不適宜時(shí)產(chǎn)生孢子進(jìn)入休眠狀態(tài)。12果醋制作原理 利用的微生物是醋酸菌 ，其異化作用類(lèi)型是需氧型。明確醋酸發(fā)酵的反應(yīng)式。13.醋瓶子、未喝干的啤酒瓶子放置久了，在醋和啤酒表面形成一層“白膜”。它是怎樣形成的？醋酸菌大量繁殖形成的14利用酒精發(fā)酵制作果酒過(guò)程中其影響因素主要有哪些? 影響酒精發(fā)酵的主要環(huán)境條件有溫度、氧氣和pH值。 酒精發(fā)酵是一般將溫度控制在2530。 酒精發(fā)酵過(guò)程中，要保持缺氧、酸性環(huán)境(pH為4.0-

33、5.8)。15影響醋酸發(fā)酵的環(huán)境因素有哪些？ 溫度、氧氣和pH16在制作葡萄酒和葡萄醋的過(guò)程中，為什么要先沖洗葡萄后去枝梗? 這樣做的目的是為了避免去枝梗時(shí)引起葡萄破損，減少被雜菌污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)也可防止葡萄汁流失。17在果酒和果醋的制作過(guò)程中如何防止發(fā)酵液被污染? 在果酒和果醋的制作過(guò)程中為防止發(fā)酵液被雜菌污染，實(shí)驗(yàn)中所用的榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置等器械要進(jìn)行消毒，如用70的酒精對(duì)榨汁機(jī)和發(fā)酵瓶消毒，同時(shí)還要使發(fā)酵裝置處于封閉狀態(tài)。18在果酒和果醋制作過(guò)程中都要充入氧氣，其作用有何不同? 果酒制作是利用酵母菌的酒精發(fā)酵，往往也要充入氧氣，主要是讓酵母菌大量繁殖，然后進(jìn)行厭氧呼吸(酒精發(fā)酵)；而在果醋

34、制作中是利用了醋桿菌的醋酸發(fā)酵，醋桿菌是好氧型細(xì)菌，需要有氧氣的參與才能進(jìn)行。19在果酒發(fā)酵和果醋發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)發(fā)酵條件的控制有什么不同? 果酒發(fā)酵和果醋發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵條件主要是在對(duì)溫度的控制要求和對(duì)氧氣的要求上，即：溫度不同，果酒發(fā)酵為2530，發(fā)酵時(shí)間一般為2天3天，若溫度較低，發(fā)酵時(shí)間則相對(duì)延長(zhǎng)；果醋發(fā)酵為30。C35，發(fā)酵時(shí)間為7天8天。對(duì)氧氣的控制不同：果酒發(fā)酵應(yīng)先通入氧氣再隔絕空氣，果醋發(fā)酵應(yīng)不斷通入足夠的氧氣。20制作果酒和果醋時(shí)，酒精濃度應(yīng)控制在多少? 果酒的酒精濃度一般控制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為l0以上，這樣才能較好地抑制微生物生長(zhǎng)，使果酒不腐敗。 醋酸的濃度控制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4-5是

35、制醋的關(guān)鍵。因?yàn)楫?dāng)濃度過(guò)高時(shí)，醋桿菌的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。因此，酒精濃度也應(yīng)控制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5左右，以提高酒精的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)10泡菜的腌制和亞硝酸的測(cè)定泡菜和酸菜都是人們喜愛(ài)的開(kāi)胃食品，它是利用天然微生物進(jìn)行發(fā)酵而制成的。這類(lèi)食品類(lèi)似于西方國(guó)家的酸乳制品。泡菜腌制過(guò)程中起作用的主要是假絲酵母和乳酸菌。但這類(lèi)食品中含有一定量的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽對(duì)人體有害，是致癌物質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是制作泡菜，所用的原料是白菜、洋白菜等。在無(wú)氧的條件下，微生物利用菜中的糖和其他營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物有有機(jī)酸和醇類(lèi)物質(zhì)等，其中也有亞硝酸(HN02)。在一定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，泡菜酸度適口，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則霉菌生長(zhǎng)過(guò)多會(huì)產(chǎn)生霉

36、變味。市場(chǎng)上有專(zhuān)用于泡菜的容器，它的口有一凹槽，凹槽加水再加蓋，造成無(wú)氧條件。加白酒的作用是可抑制雜菌的生長(zhǎng)，也是一種調(diào)味劑，增加醇香感。加鹽不要太多，否則會(huì)使乳酸菌發(fā)酵遲緩。溫度高則發(fā)酵快，但口味差些。 亞硝酸鹽是對(duì)人體有害，引起中毒，可致癌的物質(zhì)，由假絲酵母產(chǎn)生。亞硝酸鹽可與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，這一產(chǎn)物再與N一1一萘基乙二胺偶聯(lián)，形成紫紅色產(chǎn)物，可用光電比色法定量。實(shí)驗(yàn)步驟包括樣品處理、測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線（以亞硝酸鈉質(zhì)量為橫坐標(biāo)以光密度OD值為縱坐標(biāo)）、計(jì)算。問(wèn)題：1、加入白酒起什么作用？白酒可抑制泡菜表面雜菌的生長(zhǎng)，它也是一種調(diào)味劑，可增加醇香感。2、用水封閉壇口，起什么作用？不封閉

37、有什么結(jié)果？水封閉壇口起著使壇內(nèi)與壇外空氣隔絕的作用，空氣中2 1是氧氣，這是最簡(jiǎn)易的造成無(wú)氧環(huán)境的方法。這樣，壇內(nèi)可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵。如不封閉，則會(huì)有許多需氧細(xì)菌生長(zhǎng)，蔬菜會(huì)腐爛。3、厭氧發(fā)酵和有氧發(fā)酵的產(chǎn)物有什么不同？乳酸菌產(chǎn)生乳酸屬厭氧發(fā)酵；酵母產(chǎn)生乙醇屬厭氧發(fā)酵；醋酸菌產(chǎn)生乙酸屬有氧發(fā)酵，如繼續(xù)進(jìn)行有氧發(fā)酵，則產(chǎn)物被氧化而產(chǎn)生乙酸。此外，需氧微生物的作用也可使蔬菜腐爛。實(shí)驗(yàn)11植物的組織培養(yǎng)扦插、嫁接、分根、壓條和組織培養(yǎng)等都是植物無(wú)性繁殖的方法。組織培養(yǎng)就是取一部分植物組織，如葉、芽、莖、根、花瓣或花粉等，在無(wú)菌的條件下接種在三角瓶中的瓊脂培養(yǎng)基上，給予一定的溫

38、度和光照，使之產(chǎn)生愈傷組織，或進(jìn)而生根發(fā)芽。為此必須在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，兩者的摩爾濃度比決定組織是生根，還是生芽。細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素的比例高時(shí)，誘導(dǎo)芽的生成；兩者摩爾濃度大致相等時(shí)，愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)而不分化；兩者比例低時(shí)，即生長(zhǎng)素濃度相對(duì)大于細(xì)胞分裂素濃度時(shí)，才會(huì)趨于長(zhǎng)根。本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是以菊花為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)。首先用細(xì)胞分裂素(cytokinin)相對(duì)較多和生長(zhǎng)素(auxin)相對(duì)較少的培養(yǎng)基(發(fā)芽培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，使長(zhǎng)出較多的叢狀苗；然后將叢狀苗分株培養(yǎng)。分株后，再移入含有較多生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基)中，使其生根；將生根的苗從三角瓶中移至草炭土或蛭石中繼續(xù)生長(zhǎng)；苗健壯后再移至土中。實(shí)驗(yàn)中使用的生長(zhǎng)素是人工合成的萘乙酸（NAA），細(xì)胞分裂素也是人工合成的芐基腺嘌呤（BA）材料：1.