流式細胞術(shù)應(yīng)用技巧

1、 利用流式細胞儀利用流式細胞儀( flow cytometer ) 通過檢測熒光通過檢測熒光信號來檢測細胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞信號來檢測細胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并通過這些特性對細胞或顆粒核）的物理、化學(xué)特性并通過這些特性對細胞或顆粒進行進行定量。定量。 & 檢測表面標記物檢測表面標記物 & 檢測胞漿標記物檢測胞漿標記物 & 檢測胞核內(nèi)標記物檢測胞核內(nèi)標記物 & 檢測可溶性蛋白檢測可溶性蛋白流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）一、流式細胞儀的原理應(yīng)用技巧的基礎(chǔ)光源：光源：激光激光(488nm 氬離子空冷激

2、光氬離子空冷激光) 細胞：細胞： 單細胞懸單細胞懸液液 液流：液流：鞘液鞘液(Sheath Fluid) 流動室：流動室：Flow Cell檢測器：檢測器：光電倍增管光電倍增管(PMT)檢測信號：檢測信號：散射光散射光(FS，SS)，熒光信號，熒光信號(FL1FL4)統(tǒng)計分析：統(tǒng)計分析：計算機計算機散射光信號 FS 細胞大小 SS 細胞顆粒性熒光信號 FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 FL5 - PC7 用熒光標記抗體抗體特異性地結(jié)合細胞上對應(yīng)的抗原表達該抗原的細胞被標記上熒光；抗原表達多的細胞熒光強度強陽性細胞百分比或濃度靶蛋白濃度（1）、直標和間標（2）、細胞

3、膜標和細胞內(nèi)標（3）、兩種染色：抗體和染料（4）、組合標記間接免疫熒光標記法間接免疫熒光標記法直接免疫熒光標記直接免疫熒光標記法法抗原分布:Important for method optimization 表面，胞漿，核內(nèi) 是共同檢測還是分別檢測？CD3, CD4, CD8, tetramercytokinesDNACD3,4,8, tetramer+CytokinesCD3,4,8, tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8, tetramer+Cytokines+DNAIntracellular Cytokine-Protocol（1）、方案：兩種圖形（散點圖、直

4、方圖）（2）、百分率信息、強度信息（3）、分群：細胞大小（FS）細胞內(nèi)顆粒（SS）（4）、設(shè)閾值、設(shè)門特征（細分）（5）、直接信息、間接信息二、流式細胞儀的應(yīng)用技巧一 整合項目，樹立體系化概念，提高流式使用價值白血病全過程評價患者出現(xiàn)癥狀各種抗原（參照白血病抗原選擇原則）診斷白血病，確診疾病，對白血病進行分型以指導(dǎo)治療治療初診時所用抗原中能夠代表白血病細胞的特殊抗原評價療效及治療的療程同上緩解期動態(tài)跟蹤患者緩解期的白血病細胞變化，及時控制在相應(yīng)水平下臨床過程FCM檢測項目意義CIK細胞治療過程的評價治療前病人免疫狀況評價T亞群、NK、CIK、細胞因子是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做CIK采集MN

5、CMNC數(shù)目、純度、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例是否達到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細胞數(shù)MNC數(shù)目、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況培養(yǎng)培養(yǎng)是否達標、回輸時機回輸后T亞群、NK、CIK、細胞因子療效評價、監(jiān)測、下次治療的時機CIK治療程序FCM檢測項目意義云云 南南 省省 腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細細 胞胞 術(shù)術(shù) 報報 告告 單單 生物免疫治療檢測報告生物免疫治療檢測報告 門診號: 住院號: 42435 姓 名 曹淑英 性別 女 年齡 75 科別 腹一 編號 52 病床號 臨床診斷 胃癌術(shù)后 送檢標本 培養(yǎng)物 日期 2006 年 02

6、月 13 日 流式細胞檢測及分析結(jié)果：流式細胞檢測及分析結(jié)果： 采 集 前 培 養(yǎng) 后 項 目 % ABS（610） % ABS（610） CD45+CD3+ 58.5 1068 95.5 679 CD45+CD3+CD4+ 30.8 - 60.8 - CD45+CD3+CD8+ 21.1 - 21.4 - CD45+CD3-CD56+ 17.0 245 4.6 33 CD45+CD3+CD56+ 0.5 7 43.4 310 HLA DR-CD3+ 54.8 - 24.1 - HLA DR+CD3+ 15.3 - 67.2 - HLA DR-CD8+ 31.0 - 14.9 - HLA DR

7、+CD8+ 2.0 - 20.7 - 檢測日期 2006 年 01 月 13 日 2006 年 01 月 20 日 送檢醫(yī)生 周永春 實驗者 金從國、李佳 報告日期 2006 年 02 月 20 日 腫瘤細胞免疫特點AIDS全過程免疫細胞評價基礎(chǔ)免疫水平T亞群、NK、CIK當?shù)夭煌挲g、性別、民族的免疫水平基礎(chǔ)數(shù)據(jù)高危人群HIV檢測陽性T亞群、NK、CIK、 CD4凋亡、細胞因子HIV檢測陽性前的免疫水平變化狀況及CD4的凋亡T亞群、NK、CIK 、CD3、CD4、CD8活化狀況、細胞因子、CD4凋亡HIV陽性AIDS檢出HIV到發(fā)病的情況AIDS病人治療T亞群、NK、CIK、細胞因子、CD4

8、凋亡、 CD3、CD4、CD8活化狀況療效評價、監(jiān)測、治療效果及病情動態(tài)觀察AIDS過程FCM檢測項目意義骨髓移植或CD34細胞移植供者動員效果監(jiān)測圖051015202530358月4日8月5日8月5日8月6日8月6日8月7日8月7日8月8日8月8日WBC(x 109/L)MNC(x108/L)CD34+ ( x 106/L)云云 南南 省省 腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細細 胞胞 術(shù)術(shù) 報報 告告 單單 干干/ /祖細胞相對絕對計數(shù)報告祖細胞相對絕對計數(shù)報告 流式號： 門診號: 住院號 外院 姓 名 李艷華 性別 男 年齡 25 科別 外院 標本號 20

9、070919 病床號 8 臨床診斷 NHL 送檢標本 外周血 日期 2007 年 09 月 19 日 流式細胞檢測及分析結(jié)果：流式細胞檢測及分析結(jié)果： 項目 相對計數(shù) 絕對計數(shù) MNC 41.1% 30 x 108/L CD34+ 1.0% 30 x 106/L CD34+CD38- 0.9% 27 x 106/L CD34+CD38- 0.1% 3 x 106/L 送檢醫(yī)生 何迪 實驗者 金從國、陳曉群 報告日期 2007 年 09 月 19 日 凋亡啟動凋亡啟動細胞內(nèi)細胞內(nèi)Ca2+ 動員動員 Caspase激活激活脫水致細胞皺縮脫水致細胞皺縮核染色質(zhì)凝縮核染色質(zhì)凝縮 線粒體膜電位喪失線粒體

10、膜電位喪失 細胞膜細胞膜PS外翻外翻 核碎片形成核碎片形成DNA被切割成低分子量片段被切割成低分子量片段細胞內(nèi)酸化細胞內(nèi)酸化凋亡小體形成凋亡小體形成三、流式細胞儀的應(yīng)用技巧二利用儀器的靈活性，充分整合項目1 1、CIKCIK細胞作用腫瘤細胞的凋亡分細胞作用腫瘤細胞的凋亡分析析2 2、不同細胞的轉(zhuǎn)染、表達情況、不同細胞的轉(zhuǎn)染、表達情況3 3、不同分型增殖的細胞分布、不同分型增殖的細胞分布4 4、spsp細胞、非細胞、非spsp細胞細胞 5、腫瘤細胞診斷時、腫瘤細胞診斷時 （1）、胸腹水：把白細胞和癌細胞分開）、胸腹水：把白細胞和癌細胞分開 （2）、穿刺，手術(shù)細胞：）、穿刺，手術(shù)細胞： 6、組織中

11、的浸潤細胞：、組織中的浸潤細胞：7、Th1/Th2細胞的分析細胞的分析四、流式細胞儀的應(yīng)用技巧三 利用儀器提供的參數(shù)，對所做實驗全面分析評價1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中：、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中： 轉(zhuǎn)染率轉(zhuǎn)染率 疫苗疫苗 轉(zhuǎn)染的強度轉(zhuǎn)染的強度2、同時分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強度、同時分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強度3、稀有細胞的額外發(fā)現(xiàn)：、稀有細胞的額外發(fā)現(xiàn)： T亞期中：亞期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK細胞：細胞：CD3-CD16+56+ CD3+CD16+56+4、Tunecl方法中方法中 不同周期的凋亡狀況不同周期的凋亡狀況 細胞阻滯狀況細胞阻滯狀況 DNA斷片發(fā)生時斷片發(fā)生時SOS狀況狀況五、流式細胞儀的應(yīng)用技

12、巧四 了解相關(guān)知識及現(xiàn)有的評價方法，充分應(yīng)用流式細胞1. 白血病分型 形態(tài)學(xué)、免疫組化、PCR2. 細胞因子 生物活性測定法、RIA和ELISA法、DNA分析法 外周血單個核細胞產(chǎn)生細胞因子檢測法FCM、 ELI-SPOT、FCM（STAT）3. HLA B27/B7 FCM、免疫法4. 凋亡、蛋白表達 FCM、免疫組化、PCR5 . CIK、DC、CD34、CD44V、CD31等 熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙/溴化乙啶染色SGC-7901細胞24hSGC-7901蒿甲醚組24 hSGC-7901 DDP組24hECV-304細胞 24hECV-304蒿甲醚組24hECV-304 DDP組24 h六、

13、流式細胞儀的應(yīng)用技巧五 專項應(yīng)用中的問題及解決方案免疫細胞相對絕對計數(shù)免疫細胞相對絕對計數(shù)造血干細胞和其他稀有細胞的檢測造血干細胞和其他稀有細胞的檢測血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測DNA倍體分析，周期、異倍體分析倍體分析，周期、異倍體分析細胞內(nèi)因子（細胞內(nèi)因子（Th1/Th2）細胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）細胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）各種凋亡檢測（各種凋亡檢測（Apo.2.7 Tunecl、DNA亞二倍體）亞二倍體）組織中免疫細胞和其他細胞（如組織中免疫細胞和其他細胞（如CXCR、CCR）基因蛋白檢測（如基因蛋白檢測（如p53、Bcl-2等）等）白血病免疫分型白血病

14、免疫分型B27檢測檢測動物檢測過程中的問題動物檢測過程中的問題免疫細胞的檢測T細胞細胞 分群標志分群標志 活化標志活化標志 亞群標志亞群標志B細胞細胞NK細胞細胞CIK細胞細胞以T細胞亞群檢測為例，其余的免疫細胞出現(xiàn)的問題類似1、標準方案、標準方案 抗抗 凝凝 血血 組組 織織 胸腹水、灌洗液（單細胞懸液）胸腹水、灌洗液（單細胞懸液）加入加入1ml 溶血素（溶血素（NH4Cl或或C液或液或A、B、C液）液） 上機檢測上機檢測 結(jié)果：結(jié)果：CD3+ T Cell ：%、Abs CD4+ T Cell ：%、Abs CD8+ T Cell ：%、AbsCD4/ CD8比值比值 2hr內(nèi)加入內(nèi)加入

15、100ul Flow Count （100ul/份） + 10ul 抗體標本標記 15-30 min2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法（1）、標本環(huán)節(jié)）、標本環(huán)節(jié) 抗凝血：抗凝血： A、抗凝效果不好：如果沒有大的凝血塊，該血可以使、抗凝效果不好：如果沒有大的凝血塊，該血可以使 用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時最好采用用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時最好采用Fl1 （CD45所在所在）;如果有大的凝血塊，不能用于檢測。如果有大的凝血塊，不能用于檢測。 B、標本在、標本在4或以下放置過：一般不做檢測用?；蛞韵路胖眠^：一般不做檢測用。 C、標本放置時間大于、標本放置時間大于48小時：檢測時盡

16、量用小時：檢測時盡量用Fl1設(shè)閾值。設(shè)閾值。 建議：最好使用新鮮標本檢測，尤其是做絕對計數(shù)時。建議：最好使用新鮮標本檢測，尤其是做絕對計數(shù)時。 D、動物血：對于豬、猴、兔、狗等大動物的，如人一樣、動物血：對于豬、猴、兔、狗等大動物的，如人一樣 處理。而如小白鼠等小動物，由于所采血量少，需要處理。而如小白鼠等小動物，由于所采血量少，需要 先溶血，后加樣處理。如需做絕對計數(shù)，則要求計算先溶血，后加樣處理。如需做絕對計數(shù)，則要求計算 稀釋倍數(shù)，比如稀釋倍數(shù)，比如10ul血加入血加入490ul溶血素相當于稀釋了溶血素相當于稀釋了 350倍。倍。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法組織標本：組

17、織標本： 組織標本做免疫細胞時，通常需要組織標本做免疫細胞時，通常需要CD45設(shè)行設(shè)行，這樣可排，這樣可排 除非血細胞。除非血細胞。A、組織標本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：、組織標本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：這樣可以減少組織細胞的量。這樣可以減少組織細胞的量。B、穿刺細胞：手術(shù)標本需要反復(fù)清洗表面附有的血液，、穿刺細胞：手術(shù)標本需要反復(fù)清洗表面附有的血液，否則會影響檢測結(jié)果。否則會影響檢測結(jié)果。C、組織標本一般保存在生理鹽水中。、組織標本一般保存在生理鹽水中。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法胸腹水、灌洗液胸腹水、灌洗液： 通常也需要通常也需要CD45設(shè)門

18、設(shè)門A、都需要濃縮處理：一般取、都需要濃縮處理：一般取250ml左右，靜置左右，靜置4hr后取沉后取沉淀物離心。淀物離心。B、如果需要計數(shù)，則需做體積換算，比如、如果需要計數(shù)，則需做體積換算，比如250ml500ul，相當于濃縮了，相當于濃縮了500倍。倍。組織、胸腹水標本，希望做2次過濾，第一次為標記前，采用200目過濾，第二次為上機檢測前，采用300目過濾。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法（2）、抗體環(huán)節(jié)）、抗體環(huán)節(jié)試劑選擇試劑選擇A、盡量選擇試劑組合多的作為標記抗體，比如、盡量選擇試劑組合多的作為標記抗體，比如T亞群亞群CD45/CD4/CD3/CD8：最佳選擇最佳選擇CD

19、4/CD8/CD3： 可用，但做起來會有很多麻煩可用，但做起來會有很多麻煩單一抗體：單一抗體： 不可用不可用 2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法B、選擇試劑時，不但需要選擇陽性標記，同時也需要選、選擇試劑時，不但需要選擇陽性標記，同時也需要選擇陰性標記。擇陰性標記。比如：比如：CD4T 細胞細胞CD45+CD3+CD4+CD8- B 細胞細胞CD19+CD3- NK 細胞細胞CD3-CD16+56+ CD34+ 細胞細胞CD34+CD38-尤其在科研項目中，一般應(yīng)選擇尤其在科研項目中，一般應(yīng)選擇2-3個陽性標記，同時選個陽性標記，同時選擇擇1-2個陰性標記，否則所做出來的結(jié)果將會有

20、很大誤差。個陰性標記，否則所做出來的結(jié)果將會有很大誤差。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法C、在醫(yī)學(xué)中，一般標記抗原較弱的，需選擇較強的染料，、在醫(yī)學(xué)中，一般標記抗原較弱的，需選擇較強的染料，尤其我們在做稀有細胞的時候，比如尤其我們在做稀有細胞的時候，比如DC細胞，細胞，CD34細胞，細胞，CIK細胞，間充質(zhì)干細胞等，一般均選擇標記細胞，間充質(zhì)干細胞等，一般均選擇標記PE細胞。細胞。標記條件：一般18 25，如果溫度低或高效果都不好標記時間：根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于15 min。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法標記的先后順序標記的先后順序 A、先標記膜表面的，

21、后標記胞漿內(nèi)、先標記膜表面的，后標記胞漿內(nèi) B、先處理、先處理抗體抗體，后加染料，后加染料 C、透膜處理后的標本不能強烈振蕩。、透膜處理后的標本不能強烈振蕩。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法 溶血環(huán)節(jié)溶血環(huán)節(jié)溶血素的選擇溶血素的選擇 A、A B 液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀 C B、NH4Cl（主要成分是（主要成分是NH4Cl 、NH4HCO3、EDTA ） C、溶血素、溶血素C（專配試劑）（專配試劑）2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法 自配溶血素要求：自配溶血素要求： A、必須在儀器試驗后方可使用、必須在儀器試

22、驗后方可使用 B、有條件時需做、有條件時需做pH、微粒分析、微粒分析 C、放置時間不宜過長，尤其是、放置時間不宜過長，尤其是A液液2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法溶血液加入溶血液加入可能出現(xiàn)的問題可能出現(xiàn)的問題 溶血效果不好溶血效果不好v 溫度問題：溫度問題：C液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放 4冰冰 箱，可以采用水浴箱，可以采用水浴 37 v 溶血劑不夠：可以離心后追加溶血劑溶血劑不夠：可以離心后追加溶血劑 以上處理如果還不可以，則需要選擇：以上處理如果還不可以，則需要選擇：不重要的標本不重要的標本：重新再標記：重新再標記重要而又沒有剩余的標本重

23、要而又沒有剩余的標本：反復(fù)離心，選擇：反復(fù)離心，選擇1200-2000轉(zhuǎn)左轉(zhuǎn)左右的速度，建議每次離心均加入右的速度，建議每次離心均加入2-3mlNH4Cl溶血素。溶血素。有些抗體或染料對酸比較敏感：有些抗體或染料對酸比較敏感：比如比如PE標記，溶血后會使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜標記，溶血后會使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜置置10 -30 min2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法加入加入Flowcout環(huán)節(jié)環(huán)節(jié) Flowcout必須在加入溶血素后才能加入，否則會影響檢測必須在加入溶血素后才能加入，否則會影響檢測結(jié)果，同時加入結(jié)果，同時加入Flowcout后后 2 hr 后必須

24、上機檢測。后必須上機檢測。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法（5）、檢測出結(jié)果環(huán)節(jié)：）、檢測出結(jié)果環(huán)節(jié)：A、上機前需要搖勻標本，儀器開機超過、上機前需要搖勻標本，儀器開機超過30min，F(xiàn)low check 10% 2% 外電壓穩(wěn)定等等。外電壓穩(wěn)定等等。B、方案盡量采用完整方案，比如方案盡量采用完整方案，比如T亞群：亞群：由于由于Flowcout微球在所有通道上都有信號，一般選擇沒有使用微球在所有通道上都有信號，一般選擇沒有使用的熒光通道作為收集通道，如果沒有剩余通道，就選擇熒光較的熒光通道作為收集通道，如果沒有剩余通道，就選擇熒光較強的染料所在的通道強的染料所在的通道方案是實現(xiàn)正

25、確操作和得到正確結(jié)果的平臺，建議建立方 案時盡量建立完整方案2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法C、檢測結(jié)果、檢測結(jié)果1）、檢測結(jié)果必須嚴格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如）、檢測結(jié)果必須嚴格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如 CD4+T細胞細胞CD45+CD3+CD4+CD8-(百姓定義上的結(jié)果百姓定義上的結(jié)果) (醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果) 2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法2）、相對計數(shù)：一般醫(yī)院檢測）、相對計數(shù)：一般醫(yī)院檢測T亞群時可以只做相對數(shù)，這亞群時可以只做相對數(shù)，這樣就可以樣就可以使用使用prism門，門，CD3+%、CD4+%、CD8+ %，如果需如果需要濃度，則從血常規(guī)

26、中得到要濃度，則從血常規(guī)中得到 淋巴細胞淋巴細胞的濃度的濃度 * 相應(yīng)的相應(yīng)的 % = 濃濃度（即所謂度（即所謂的的 雙平臺法雙平臺法），這時我們可以采用縮小設(shè)行的辦），這時我們可以采用縮小設(shè)行的辦法，得到準確的法，得到準確的%。3）、絕對計數(shù)：）、絕對計數(shù)：AIDS往往采用單平臺法得到濃度，這樣我們往往采用單平臺法得到濃度，這樣我們可以采用擴大設(shè)行方法得到準確的絕對數(shù)?？梢圆捎脭U大設(shè)行方法得到準確的絕對數(shù)。2、可能的問題及解決辦法、可能的問題及解決辦法3）、影響結(jié)果的因素：）、影響結(jié)果的因素： 電壓、補償不足或過頭均影響電壓、補償不足或過頭均影響 閾值設(shè)置不合理閾值設(shè)置不合理 設(shè)門設(shè)門范圍范

27、圍 FlowcoutDNA檢測1、固定問題：、固定問題：70%酒精酒精 106 細胞細胞 700 ul 冰乙醇冰乙醇2-3min2-3min300 ul 蒸餾水蒸餾水4-72 hr2、離心：、離心：1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)3、透膜：、透膜： triton x -100 （intra 1、intra 2）細胞因子的檢測1、解決干擾碎片、解決干擾碎片（1）、）、-20靜置，靜置，24hr（2）、）、4500轉(zhuǎn)，離心轉(zhuǎn)，離心2、強度問題：外延濃度、強度問題：外延濃度 0、5、10、20Capture BeadsCapture BeadsLysate SampleLysate SampleDetector Ant

28、ibodiesDetector AntibodiesWashWashAnalyze on Analyze on flow flow cytometercytometer多種細胞因子FCM（STAT）的原理Color-coded MicrospheresFL4Main MenuDifferentiation of 10 Populations*Human Th1/Th2 Cytokine I KitFL2 (Reporter Parameter)FL4(Differentiator Parameter)Main MenuHLA-B27 檢測中的問題 利用B27 熒光強度判定的陽性率很低。 原因：

29、 通常B27的判定標準是熒光強度大于8 ，但這個標準是在加全量抗體的條件下做的，而目前大多數(shù)用戶只加半量或1/4量做，導(dǎo)致熒光強度降低。 解決方法： 1 加全量抗體。 2 判定標準改為用陽性率大于90%。ANNEXIN V/PI檢測凋亡的問題 結(jié)果偏低 原因：1 沒有用試劑配套的連接緩沖液。 2 消化貼壁細胞時用胰酶。 解決方法：1 消化細胞時不要用胰酶，要用EDTA，用配套的緩沖液。PNH檢測的問題 粒細胞上CD55，CD59檢測結(jié)果偏低，而在紅細胞上正常。 原因：在進行抗體染色之前，沒有進行溶血，導(dǎo)致了抗體先和紅細胞結(jié)合，而無法與白細胞充分反應(yīng)，產(chǎn)生了陰性結(jié)果。 解決方法：在染色之前，先進行溶血洗滌，然后再染色。