地塞米松對HUVEC表達粘附分子的影響

1、    地塞米松對HUVEC表達粘附分子的影響        摘要研究地塞米松、rIL-1ra對內(nèi)皮細胞表達粘附分子的影響，為炎癥反應(yīng)的病理過程提供理論依據(jù)。用rTNF、rIL-1和LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），以地塞米松或rIL-1ra處理LPS或rIL-1誘導(dǎo)的HUVEC，采用Cell-ELISA法檢測粘附分子ICMA-1和ELAM-1的表達。結(jié)果：rTNF、rIL-1和LPS提高HUVEC表達ICAM-1和ELAM-1；地塞米松、rIL-1ra抑制rI

2、L-1誘導(dǎo)的粘附分子表達。表明地塞米松、rIL-1ra以不同機制抑制HUVEC表達ICAM-1和ELAM-1。關(guān)鍵詞地塞米松人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）細胞因子粘附分子中號R392.11 EFFECTS OF DEXAMETHASONE ON EXPRESSION OF ADHESION MOLECULES BY ACTIVATED HUVECZhang Qingyin，He Weijing，Hou Guihua，Liwei（Affiliated Hospital of Shandong Medical University，Jinan 250012）Abstract In order to

3、 study the effects of Dexamethasone and rIL-1ra on the expression of adhesion molecules by activated endothelial cells，and to provide evidence for pathologic course of inflammatory reactionCell-ELISA method was used to detect ICAM-1 and ELAM-1 expression on human umbilical vein cells（HUVEC） stimulat

4、ed with rTNF、IL-1 and LPSThe results showed rTNF、rIL-1 and LPS could induce the expression of ICAM-1 and ELAM-1 on HUVEC，whereas dexamethasone and rIL-1ra inhibited HUVEC to express ICAM-1 and ELAM-1 on HUVEC induced with rIL-1The findings indicate that Dexamethasone and rIL-1ra might inhibit the ex

5、pression of adhesion molecule ICAM-1 and ELAM-1 by different mechanism respectivelyKey words Dexamethasone，Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC），Cytokine，Adhesion molecules炎癥反應(yīng)過程中，內(nèi)皮細胞既可以作為細胞因子、炎性因子作用的靶細胞，又可分泌細胞因子、介導(dǎo)細胞粘附。中性粒細胞、淋巴細胞穿越內(nèi)皮到達炎癥部位殺菌消炎與皮細胞表達粘附分子有關(guān)1。細胞間粘附分子-1（Intercellularadhesionmo

6、lecule-1，ICAM-1）和內(nèi)皮細胞白細胞粘附分子（Endothelialleukocyteadhesionmolecule-1，ELAM-1）均可在活化的血管內(nèi)皮細胞膜上表達。某些研究結(jié)果表明，白細胞可通過其表面的配體與ICAM-1及VCAM-1相互作用，粘附于血管內(nèi)皮細胞的表面2。本研究采用Cell-ELISA法檢測了粘附分子的表達，探討內(nèi)皮細胞粘附分子的表達的影響因素。1材料和方法1.1材料臍帶標(biāo)本：健康產(chǎn)婦正常分娩后取新生兒臍帶。標(biāo)本取自山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科。試劑：培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)液，GIBCO公司產(chǎn)品。內(nèi)含青霉素100Uml，鏈霉素100gml，使用時加入20新

7、生牛血清。胰蛋白酶，Sigma公司產(chǎn)品，用RPMI1640培養(yǎng)液配成025濃度，rIL-1，10萬Uml，rTNF 5萬Uml，購于北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司。Anti-ICAM-1，12mgml，Anti-ELAM-1，18mgml，BritishBiotechnology（OxfordUK）產(chǎn)品，均為小鼠IgG1。rIL-1ra650gml，北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室馬大龍教授惠贈。地塞米松5mgml，濟南永寧制藥公司。LPS，5mgml，為Sigma公司產(chǎn)品。1.2方法HUVEC原代培養(yǎng)：將正常分娩12h內(nèi)的臍帶，用pH72的PBS沖洗其靜脈至肉眼無色為止，然后注入025胰蛋白酶，置37

8、6;C水浴1518min，收集臍靜脈內(nèi)消化液，再用20FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液灌洗。離心后棄上清，以20FCS的RPMI1640制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度分種于1明膠預(yù)包被的96孔板上，置37°C5CO2條件下培養(yǎng)。至形成致密單層后，去除培養(yǎng)上清，沖洗后的HUVEC單層用于ICAM-1和ELAM-1表達試驗。粘附分子ICAM-和ELAM-1表達的誘導(dǎo)：在含有HUVEC單層的96孔板內(nèi)，分別加入rTNF500Uml，rIL-1100Uml或LPS1gml誘導(dǎo)6h，測ICAM-1和ELAM-1的表達。采用rTNF500Uml，rIL-1100Uml，LPS1gml分別和地塞米松1

9、00nM同時作用HUVEC6h。加不同濃度的地塞米松與1gmlLPS誘導(dǎo)HUVEC6h。rIL-1（1gml）和rIL-1（1gml）地塞米松（10nM）誘導(dǎo)HUVEC6h，測ICAM-1和ELAM-1表達。rIL-1ra處理后的HUVEC，然后用rIL-1誘導(dǎo)。ICAM-1和ELAM-1抗原的檢測3：細胞因子作用后的HUVEC單層，用pH72的PBS沖洗兩遍，用1戊二醛4°C固定30min，用含005Tween20的PBS洗板3次，用3BSA封閉40min，200l孔，洗板后加入鼠抗人ICAM-1（04gml）或ELAM-1（06gml）單抗，50l孔，37°C置1h，洗

10、板3次后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG100l孔，37°C1h，預(yù)溫結(jié)束加TBM-H2O2 100 l，37°C顯色15min，加2N H2SO4終止反應(yīng)。450nm處讀取光密度值。實驗測定OD450刺激組OD450本底對照OD450。ICAM-1和ELAM-1表達以下列公式計算：統(tǒng)計學(xué)處理：采用t檢驗2結(jié)果2.1rTNF、rIL-1及LPS對HUVE表達ICAM-1和ELAM-1的影響選用rTNF500Uml，rIL-1100Uml，LPS1 gml誘導(dǎo)HUVEC單層6h，測ICAM-1和ELAM-1的表達。結(jié)果顯示，3種誘導(dǎo)因子均可明顯誘導(dǎo)2種粘附分子的表達，明顯高于未刺激

11、的HUVEC（P005）。兩種粘附分子的表達之間未見明顯差異（P005），見1。1rTNF，rIL-1及LPS對HUVEC表達ICAM-1和ELAM-1的影響（n8）Fig1EffectsofrTNF，rIL-1andLPSonexpressionofICAM-1andELAM-1byHUVEC（n8）2.2地塞米松對rTNF、rIL-1和LPS誘導(dǎo)的HVUEC表達ELAM-1的影響采用rTNF500Uml，rIL-1 100Uml，LPS1gml，分別和地塞米松100nM同時作用HUVEC6h，刺激因子誘導(dǎo)的ELAM-1表達以百分對照表達的百分率表示，見2。結(jié)果顯示，地塞米松明顯抑制rIL-

12、1和LPS誘導(dǎo)的ELAM-1表達。100nM的地塞米松可使rIL-1誘導(dǎo)的ELAM-1表達下降60；使LPS誘導(dǎo)的ELAM-1表達降69；而對rTNF誘導(dǎo)的ELAM-1表達無影響。2地塞米松對rTNF，rIL-1和LPS誘導(dǎo)ELAM-1表達的影響（n8）Fig2EffectsofDexamethasoneonELAM-1expressioninducedbyrTNF，rIL-1andLPS（n8）2.3地塞米松抑制ICAM-1和ELAM-1表達的劑量依賴效應(yīng)不同劑量的地塞米松，對1gmlLPS誘導(dǎo)的HUVEC表達ICAM-1和ELAM-1分子，表現(xiàn)不同的抑制作用，01nM的地塞米松即可表現(xiàn)明顯

13、的抑制作用，當(dāng)濃度增加至10nM時，抑制效應(yīng)達最大值，見3。3地塞米松對LPS誘導(dǎo)的ICAM-1和ELAM-1表達的劑量依賴抑制效應(yīng)（n5）Fig3Dose-dependentinhibitoryeffectsofDexamethasoneonexpressionofICAM-1andELAM-1inducedbyLPS（n5）2.4地塞米松對rIL-1誘導(dǎo)的ICAM-1和ELAM-1表達的抑制作用rIL-1（1gml）和rIL-1（1gml）地塞米松（10 nM）誘導(dǎo)HUVEC，測ICAM-1和ELAM-1表達。結(jié)果顯示，rIL-1和rIL-1地塞米松處理后的ICAM-1和ELAM-1表達明

14、顯高于單用地塞米松和未誘導(dǎo)組（P005）；rIL-1和rIL-1地塞米松處理后的ICAM-1和ELAM-1表達表現(xiàn)明顯差異（P005），見4。4地塞米松對rIL-1誘導(dǎo)ICAM-1和ELAM-1表達的抑制作用（n8）Fig4InhibitoryeffectsofDexamethasoneontheexpressionofICAM-1andELAM-1（n8）2.5rIL-1ra對rIL-1誘導(dǎo)的HUVEC表達ELAM-1的抑制作用不同濃度的rIL-1ra加至HUVEC預(yù)處理10min，然后再加rIL-1 100Uml，6h后測ELAM-1的表達。實驗表明10ngml和100ngml的rIL-1

15、ra不能抑制ELAM-1的表達，1000ngml時則表現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)，當(dāng)rIL-1ra濃度增至10000ngml時，ELAM-1的表達降至56。LPS誘導(dǎo)的ELAM-1的表達則不能被rIL-1ra抑制,見表1。表1rIL-1ra對rIL-1誘導(dǎo)HUVEC表達ELAM-1的抑制作用Tab1InhibitoryeffectofrIL-1raonELAM-1expressionbyHUVECinducedwithrIL-1rIL-1raconcentration（×103ngml）controlexpression±srIL-1（100Uml）LPS（1gml）001102&#

16、177;28*96±5601105±71*106±391085±55*102±8110056±81*98±117100054±34*102±64*P005；?*P001comparedwithLPS3討論在炎癥組織中，白細胞與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生粘附是白細胞在血管內(nèi)靠邊和游走至血管壁外的前提，也是中性粒細胞損傷血管內(nèi)皮的基礎(chǔ)，在炎癥過程中白細胞粘附穿越內(nèi)皮往往與粘附分子的表達有關(guān)，在急性炎癥反應(yīng)的早期，內(nèi)皮細胞表達ELAM-1分子，可以和中性粒細胞、淋巴細胞以及單核細胞表面的特異性配體結(jié)合，而內(nèi)皮細胞ICAM

17、-1表達較晚，主要介導(dǎo)中性粒細胞及單核細胞的粘附1。內(nèi)皮細胞粘附分子在白細胞遷移過程中的作用也有差異，ELAM-1在白細胞與血管內(nèi)皮初粘附時起主要作用，ICAM-1與白細胞表面的CD11CD18配體結(jié)合辯認(rèn)起始結(jié)合位點。單核細胞、中性粒細胞表面的P-selectin與ELAM-1結(jié)合，主要介導(dǎo)這些細胞沿內(nèi)皮細胞表面滾動，然后白細胞受趨化因子的激活與ICAM-1發(fā)生強粘附，進一步促進白細胞穿越內(nèi)皮2。糖皮質(zhì)類固醇是一類應(yīng)用廣泛的有效的抗炎藥物，其抗炎機理尚未完全明了。曾有報道地塞米松可減少前炎癥細胞因子的合成5，抑制急性和慢性炎癥反應(yīng)中白細胞和內(nèi)皮細胞的粘附6，抑制由細胞因子激活的粘附分子mRN

18、A基因轉(zhuǎn)錄7。我們對地塞米松調(diào)節(jié)HUVEC粘附分子ICAM-1和ELAM-1表達作了研究，結(jié)果表明地塞米松可明顯抑制rIL-1和LPS誘導(dǎo)的ICAM-1和ELAM-1的表達。因此，地塞米松抑制白細胞進入炎癥部位，可以通過抑制內(nèi)皮細胞粘附分子的表達發(fā)揮作用。IL-1ra由于競爭性結(jié)合HUVEC表面的IL-1受體，而阻斷IL-1的生物學(xué)效應(yīng)。所以用IL-1ra預(yù)處理HUVEC后，rIL-1誘導(dǎo)的ELAM-1表達可被抑制。動物實驗證明IL-1ra具有抗炎效應(yīng)8。*山東省自然科學(xué)基金會青年科學(xué)基金資助項目（項目號：Q94C0717）作者單位：張慶殷何維敬李偉山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科濟南 240012

19、候桂華山東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)教研室第一作者：男，33歲，碩士，主治醫(yī)師參考文獻1Pober TS， Cotran RCytokine and endothelial cell BiologyPhysiol Review，1990，704272 Oppenheimer-marks N，Davis LS，Bogue DT，et alDifferential utilization of ICAM-1 and VCAM-1 during the adhesion and transendothelial migration of human T lymphocytes，1991，147：291

20、33 Vanhee D，Delneste Y，Lassalle P，et alMadulation of endothelial cell adhesion molecule expression in a situation of chronic inflammatory stimulationCell Immunol，1994，155：4464 Frank Bennett C，Condon TP，Grimm S，et alInhibition of endothelial cell adhesion molecule expression with antisense oligonucleotidesJ Immunol，1994，152：35305 Kern JA，Lamb RJ，Reed JC，et alDexamethasone inhibition of interleukin-1（production by human monocyt